长链非编码RNA以竞争性内源RNA角色调控胃癌发生的机制研究

摘要

一、研究目的：
　　近年来的研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）与肿瘤发生发展密切相关，影响肿瘤细胞生长、凋亡、浸润和转移。lncRNA通过多种机制发挥生物学功能，可能在转录水平、转录后水平和翻译水平等层面影响基因表达调控。由于lncRNA种类和功能的多样性，致使其生物学功能的阐明并非易事。
　　鉴于胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，本论文以胃癌作为研究对象，采用多种生物化学与分子生物学实验技术，希望说明以竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）角色影响胃癌发生是lncRNA的生物学功能之一。
　　二、实验方法：
　　1.先通过lncRNA芯片筛选胃癌组织和癌旁组织中差异表达的lncRNA；然后使用miRcode软件和TarBase数据库预测一些主要lncRNA和肿瘤相关mRNA之间共享的miRNA。
　　2.为验证lncRNA芯片结果，以表达水平差异最大的lncRNA—FER1L4为研究对象，采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reversetranscription-polymerase
　　chain reaction，qRT-PCR）检测胃癌组织及对应癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS、MGC-803、SGC-7901中FER1L4的表达水平。
　　3.双萤光素酶报告基因实验证明FER1L4是否为miR-106a-5p的靶标之一。
　　4. miR-106a-5p类似物（mimic）转染GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞，qRT-PCR检测miR-106a-5p靶标FER1L4和PTEN mRNA的水平。
　　5.设计并合成针对FER1L4的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），然后转染至GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞中，qRT-PCR检测FER1L4、miR-106a-5p、PTENmRNA的水平变化，蛋白质印迹（Western blot）检测PTEN蛋白水平变化。
　　6.FER1L4沉默后，分别采用流式细胞仪（flow cytometer）和实时细胞分析仪（Real-Time Cell Analyzer，RTCA）检测细胞周期和细胞增殖的变化。
　　三、实验结果：
　　1. lncRNA芯片结果表明，在胃癌组织和癌旁组织中表达差异3倍以上的lncRNA有53种；结合生物信息学技术构建了胃癌相关ceRNA（lncRNA-miRNA-mRNA）网络图。
　　2.使用qRT-PCR技术检测大样本量胃癌组织和3株胃癌细胞株中FER1L4的表达水平，证实它在胃癌组织和胃癌细胞株中均呈现低表达。
　　3.双萤光素酶报告基因实验表明，FER1L4与miR-106a-5p间存在直接相互作用，前者为后者的靶标之一。
　　4.转染miR-106a-5p类似物后，FER1L4和PTEN mRNA在GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞中的表达水平均降低。
　　5. siRNA-FER1L4在有效沉默GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞中FER1L4表达的同时，上调miR-106a-5p的水平，在mRNA和蛋白质水平下调PTEN表达。
　　6.机制分析发现，下调FER1L4导致细胞增殖加快的原因是促进细胞从G0/G1期进入S期。
　　四、结论：
　　在胃癌组织和胃癌细胞株中均低表达的FER1L4是致癌性miRNA—miR-106a-5p的靶标之一。在正常胃黏膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS、MGC-803、SGC-7901中，当下调FER1L4表达水平时，将导致miR-106a-5p的水平上调和它的另一靶标PTEN mRNA的下调。总之，FER1L4发挥抑癌作用的可能机制之一是以ceRNA角色调控抑癌基因PTEN的表达。

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引言

1研究内容和技术路线

1.1研究内容

1.2技术路线

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3实验结果

3.1胃癌相关ceRNA网络

3.2 FER1L4在胃癌组织和胃癌细胞中低表达

3.3 FER1L4与miR-106a-5p直接相互作用

3.4 miR-106a-5p降低FER1L4和PTEN的表达水平

3.5下调FER1L4对miR-106a-5p水平的影响

3.6下调FER1L4对PTEN表达水平的影响

3.7下调FER1L4对细胞周期的影响

3.8下调FER1L4对细胞增殖的影响

4讨论

5全文小结

参考文献

附录A缩略词

附录B综述

在学研究成果

致谢