大黄鱼免疫球蛋白单抗的制备及在虹彩病毒疫苗效果评价中的应用研究

摘要

大黄鱼是中国最重要的海水养殖鱼类。近年来，网箱养殖大黄鱼受到各类寄生虫、弧菌、假单胞以及病毒病的威胁。2005年以来，研究报道表明虹彩病毒科肿大细胞病毒属的病毒感染各种包括大黄鱼在内的各种海水鱼类，造成严重的经济损失，特别在中国东海养殖区域较为严重。疫苗将有可能成为一种效果明显、无环境危害的虹彩病毒防控措施，但病毒疫苗的研制需建立一种有效的疫苗效果评价方法。
　　本研究采用硫酸胺沉淀法和亲和柱层析法分离提取大黄鱼免疫球蛋白，硫酸胺沉淀法采用20-50％饱和度的硫酸铵进行分级沉淀；亲和层析采用 GE公司的高效 A蛋白柱和高效 G蛋白柱直接吸附鱼血清中的免疫球蛋白，结果表明A蛋白柱可从大黄鱼血清直接提取纯化IgM，对IgM有良好的提取回收率和良好的纯度，血清不需经预处理；而 G蛋白柱提取的大黄鱼 IgM与柱结合较弱，回收率差。SDS-PAGE电泳表明经 A蛋白柱提取的IgM显示两条带，与大黄鱼的重链（H链）和轻链（L链）大小相对应。
　　用纯化的IgM与弗氏佐剂，以0.5mg/只腹腔注射 Balb/c小鼠，首次免疫采用完全佐剂乳化(含卡介苗)，第二次起采用不完全佐剂注射，共进行5次注射。收集免疫后小鼠血清，用大黄鱼纯化抗体预包被酶标板，测定小鼠血清的ELISA滴度。小鼠血清与大黄鱼抗体有良好的抗体效价，ELISA滴度达1：16000，与草鱼、鲫鱼和鳊鱼抗体无交叉反应，但与黑鱼、鳜鱼和加州鲈等鲈形目鱼类存在一定的交叉反应。取经大黄鱼纯化抗体免疫后的小鼠，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0融合，用加 HAT选择的1640培养基筛选杂交瘤细胞，再用提纯大黄鱼IgM包被ELISA板，采用间接ELISA法筛选抗大黄鱼IgM特异性抗体，单抗显示较好的特异性，与鲈形目其他鱼类无交叉反应。
　　收集虹彩病毒 PCR阳性的患病大黄鱼，取病毒组织，经均匀后，离心取上清液，用10%PEG+0.5M NaCl沉淀病毒，提粗纯化病毒，用此病毒包被 ELISA板，建立了测定病毒的间接ELISA法。用该法检测虹彩病毒阳性的患病大黄鱼血清和无发病史的健康大黄鱼血清，结果表明健康大黄鱼无抗虹彩病毒抗体，效价低于1:16，而患病鱼的抗病毒效价达1：128以上。试验结果表明制备的抗大黄鱼二抗可较好地应用于大黄鱼抗体效价测定，可用于测定疫苗引发的抗体效价，是疫苗效果评估的良好方法。

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英文摘要

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1. Introduction

2. Goal of the Study

3. Literature Review

3.1 Large yellow croaker in China

3.2 The main diseases of large yellow croaker in China

3.3 The Iridovirus

4. Materials and Methods

4.1 Isolation and Characterization of IgM from yellow croaker

4.2 Preparing of Second Antibody against LYC IgM with mice.

4.3 Preparing of Monoclonal Antibodies against LYC IgM with mice.

4.4 application of second antibody for LYC antibody against iridovirus

5. RESULTS

5.1 Isolation of IgM from yellow croaker

5.2 Characterization of LYC-IgM with SDS-PAGE

5.3 Specific tests to IgM with ELISA

5.4 Screening of Mice for Antibody Production

5.5 Hybridoma choosing and antibody against LYC IgM screening

5.5 Amplification of LYC iridovirus MCP gene with PCR

5.6 LYC antibody level test with prepared second antibody to IgM

6. DISCUSSIONS

Conclusion

Common used Buffer

致谢

参考文献