人类巨细胞病毒感染对脐血粒单系祖细胞增殖过程中HOXA5，HOXB6基因表达的影响

摘要

目的：本课题主要探讨人类造血干祖细胞(HematopoieticStem-ProgenitorCell，HSPC)向粒单系(ColonyFormingUnit-Granulocyte-macrophage，CFU-GM)增殖过程中HOXB6，HOXA5基因表达的情况，并且用人类巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)和/或全反式维甲酸(all-trans-retinoticacid，ATRA)进行干扰，以探讨HCMV、ATRA在此过程中对HOXB6、HOXA5基因的影响，以进一步明确HCMV抑制脐血粒单系祖细胞增殖的机制，以及ATRA能有效治疗粒系白血病，尤其是急性早幼粒细胞白血病的可能机制。 方法：1.脐血标本由本院产房提供，取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血。 2.实验分组。实验分4组：(1)空白对照组：不加病毒液，代之等量IMDM加入基本培养体系。(2)HCMV组：HCMV-AD169滴度为组织培养半数感染量(tissuecultureinfectious，TCID50)10-4.5/0.1ml，按100TCID500.1ml感染培养体系。(3)ATRA组：加入ATRA稀释液0.1ml，终浓度60nmol/()l。(4)HCMV+ATRA组：同时加入HCMV-AD169病毒稀释液0.1ml及ATRA0.1ml，终浓度同上。 3.采用造血祖细胞体外培养技术，以HCMV-AD169和/或ATRA持续干扰人类造血干祖细胞，观察正常组、HCMV-AD169组、ATRA组、以及ATRA+HCMV组的人类造血干祖细胞经人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating，GM-CSF)诱导后，在培养过程第3天，7天和12天的粒单系祖细胞集落(ColonyFormingUnit-Granulocyte-macrophage,CFU-GM)生成情况。 4.采用瑞-姬染色法鉴定粒单系祖细胞。 5.分别抽提各时间点，各不同分组细胞总RNA。 6.将抽提到的各时间点，不同分组细胞总RNA逆转录为CDNA，通过实时定量PCR技术(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction，RQ-PCR)检测各组细胞增殖分化过程中HOXB6、HOXA5基因的表达情况。 7.随机抽取6例逆转录的HOXB6、HOXA5基因进行电泳，获得HOXB6、HOXA5电泳图。 8.统计方法：结果用DNA相对拷贝数和RNA表达相对量(2-△△Ct)表示HOXB6、HOXA5基因相对表达量，采用均数加减标准差((-X)±S)表示HOXB6、HOXA5基因的变化情况。进行方差齐性检验，ONE-WAY方差分析，组间均数两两比较用LSD法。由统计学软件SPSS13.0完成。 结果：(1)人类造血干祖细胞向粒单系祖细胞增殖分化过程中，正常对照组、HCMV组、ATRA组、及HCMV+ATRA组的HOXA5基因均不规律表达，且表达多为阴性。(2)HOXB6基因在各组均表达，且表达强烈。(3)随时间推移，正常对照组、HCMV组、ATRA组、及HCMV+ATRA组，HOXB6基因均在增殖分化的第7天表达最强烈，第12天表达明显减弱。(4)与正常对照组比较，HOXB6基因受ATRA(60nmol/()l)的上调。(5)与正常对照组比较，HOXB6基因受HCMV下调。(6)与HCMV组比较，ATRA能抑制HCMV所致的HOXB6基因下调。(7)提取的总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳结果如图，可见28S、18S、5S三条带，无DNA污染条带，无明显降解条带，表明提取的总RNA纯度较高。(8)1.5％琼脂糖凝胶电泳结果见HOXB6、HOXA5基因DNA扩增条带清晰，没有杂带，说明引物设计合成无误。(9)RQ-PCR方法定量目的基因具有特异性好，灵敏度高等优点。 结论：1.HOXA5基因可能不是人类造血干祖细胞向粒单系祖细胞增殖分化过程的主控基因。 2.HOXB6基因是人类造血干祖细胞向粒单系祖细胞增殖分化过程的主控基因之一。 3.HOXB6基因在人类造血干祖细胞向粒单系细胞的正常增殖分化过程中呈现时间上的规律性。 4.HCMV能下调HOXB6基因的表达，同时经HCMV干扰的细胞在倒置显微镜下观察，集落生成较正常组差。HCMV可能通过调控HOXB6基因表达异常引起造血干祖细胞增殖分化异常。 5.低浓度(60nmol/()l)ATRA能显著上调HOXB6基因的表达，提示ATRA治疗白血病的机制可能与其调控同源盒基因有关。 6.在HCMV感染细胞的基础上以ATRA持续作用，表现为ATRA抑制HCMV引起的HOXB6基因下调效应。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

缩写词表

致谢

综述 HOx基因及其在造血干/祖细胞增殖分化中的作用

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