尼莫地平和拉莫三嗪对急性癫痫大鼠海马CA3区神经元损害的保护作用研究

摘要

目的：用马桑内酯(coriaria lactone,CL)制作急性癫痫脑损伤模型，采用尼莫地平单药及联合拉莫三嗪用药观察大鼠海马(hippocampal)CA3区形态学改变，神经元凋亡和P53蛋白表达的变化，了解神经元凋亡及p53蛋白表达与急性癫痫之间的关系，探讨离子通道阻滞剂在抗癫痫治疗中最佳联合用药方案，指导临床合理用药奠定理论基础。 方法：云南系健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只随机分为5组，致痫前15min，B,C,D组分别给予尼莫地平(nimotopine)1mg/kg,拉莫三嗪(lamotrigine)10mg/kg和尼莫地平1mg/kg+拉莫三嗪10mg/kg灌胃，M2组给予生理盐水灌胃后，B,C,D,M1,M2组大鼠从前囟后方1mm，中线旁开2mm处刺穿颅骨，按0.5ul/100g行侧脑室(lateral ventricle,LV)注射马桑内酯制备急性癫痫大鼠模型，出现癫痫发作按Racine分级[1]判定，根据惊厥程度将行为表现分五级，Ⅰ级：咀嚼运动；Ⅱ级：颈部肌肉抽搐；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：站立并双前肢阵挛；Ⅴ级：四肢抽搐，失去平衡跌倒。Ⅲ级以上为成功制作癫痫模型，A组大鼠行侧脑室注射生理盐水，未见癫痫发作。,B,C,D组大鼠于致痫后48h开始按上述剂量灌胃给药，每天一次，致痫组和对照组给予等量的生理盐水灌胃处理，空白对照组和致痫后48h组(M2)，于造模后48h以4％多聚甲醛灌注固定，B,C,D，M1组大鼠与造模后第14d以4％多聚甲醛灌注固定后取脑，常规石蜡包埋切片(片厚4 μ m)，采用HE染色，原位末端标记(TUNEL)和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素生物素法测定海马CA3区神经元凋亡与P53蛋白表达情况。采用半定量计数海马CA3区线形1mm长度阳性细胞数，对统计结果用析因设计方差分析及直线相关与回归分析。 结果： 1．HE染色：对照组大鼠海马CA3区神经元呈带状分布，数量较多，排列较整齐，细胞形态完整，细胞外组织间隙正常。CA3区锥体细胞体积较大，核大而圆，位于细胞中央，染为淡蓝色；核仁，核膜清晰，核仁呈深紫色；胞质均匀，尼氏体呈密集分布的细小颗粒状；部分细胞突起可见(图4)。模型组大鼠海马CA3区细胞仍呈带状分布，但排列紊乱，形态改变；细胞排列稀疏，细胞丢失明显；残存细胞体积变小，胞体收缩呈多角形或极不规则，胞浆浓缩，染为深蓝色，核固缩深染，结构不清，部分细胞可见缩短深染的突起；细胞及血管周围间隙增大(图5)。 2．免疫组化及TUNEL染色结果：光镜下P53阳性细胞胞浆不着色，胞核染棕褐色，致痫组大鼠海马CA3区神经细胞核碎裂，偏位，大小不一；锥体细胞被破坏，TUNEL染色凋亡神经细胞核呈棕褐色，染色质聚集核周呈新月形或块状小体及核固缩的凋亡小体。与对照组相比,模型组海马CA3区P53阳性细胞数及凋亡细胞数显著增多(P＜0.05)。尼莫地平组大鼠海马CA3区P53阳性细胞数较致痫组减少，TUNEL染色显示凋亡细胞数与致痫组相比数量减少(P＜0.05)。拉莫三嗪组大鼠海马CA3区P53阳性细胞数较致痫组，尼莫地平组减少，TUNEL染色显示凋亡细胞数较模型组减少(P＜0.05)。联合组大鼠海马CA3区变性，坏死神经元与尼莫地平组，拉莫三嗪组相比数量明显减少。见有3-4层锥体细胞排列整齐紧密，高倍镜下可见锥体细胞核大而圆，透明，1-2个明显核仁。P53阳性细胞数较尼莫地平组，拉莫三嗪组减少(P<0.05)，TUNEL染色未见凋亡细胞，与对照组相比较差异无显著性(P>0.05)。 结论： 1．马桑内酯诱导的急性癫痫动物模型是一种研究癫痫持续状态机制较理想的模型。 2．癫痫发作状态下，海马CA3区神经元凋亡增加，p53蛋白阳性表达数目增加，提示癫痫发作所致神经元损伤与p53基因激活有关。 3．治疗组中，尼莫地平与拉莫三嗪联合用药对马桑内酯致痫大鼠海马CA3区神经元凋亡和P53蛋白表达有抑制作用，联合用药对痫性发作引起神经元凋亡有保护作用，优于单药组，可以最大限度抑制癫痫发作和神经元凋亡，避免癫痫并发症的发生，提高生存质量。

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P53与癫痫神经元损伤 综述

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