丹酚酸A诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用及机制研究

摘要

研究背景：丹酚酸 A（Salvianolic acid A, SAA）是传统中药丹参的一种水溶性提取物，研究证实其具有抗炎、抗血栓形成等多种生物学作用，但其抗肿瘤作用尤其是对急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）的调控作用尚未见报道。
　　研究目的：探索SAA在体内外对 AML细胞生长增殖、凋亡等的调节作用以及对 PI3K/Akt信号通路的影响；并进一步探索 SAA对初发成人AML患者中提取的原代肿瘤细胞及正常骨髓单核细胞的作用差异。
　　研究方法：1.MTS法检测 SAA作用下对 AML细胞活性的影响；PI/Annexin V双染法检测SAA是否诱导 AML细胞凋亡，并用免疫蛋白印记（Western blot）法进一步检测 SAA作用下凋亡相关蛋白 Bcl-xL、Bak、caspase-3、PARP及PI3K/Akt信号通路中关键蛋白分子的表达水平变化；2.构建BALB/c裸鼠AML皮下成瘤模型，腹腔注射 SAA研究 SAA在裸鼠体内对 AML肿瘤生长速度的影响；3.Ficoll分离初发 AML患者与非骨髓恶性增殖性疾病患者骨髓中的单个核细胞（BMMCs），比较 SAA诱导两组细胞发生凋亡的作用及差异；实验结果 SAA对 AML的三个细胞株（THP-1, KG-1, Kasumi-1）均能显著抑制其细胞活性，且 SAA作用24小时的半数抑制率（IC50）分别为42.55μM、39.16μM和5.86μM；SAA通过活化线粒体凋亡通路，活化 PARP、caspase-3等凋亡相关蛋白从而显著诱导 AML细胞凋亡，且其作用效果与 SAA的浓度及作用时间相关；SAA作用后AML细胞中p-Akt表达下降，明显抑制PI3K/Akt信号通路的活性。体外实验结果证实腹腔注射 SAA能抑制小鼠体内 AML肿瘤细胞生长。另外，更重要的是我们发现 SAA对于原代 AML肿瘤细胞也具有同样的诱导凋亡作用，且与正常骨髓单核细胞相比其促凋亡作用更为显著。
　　结论：我们的研究表明 SAA在 AML中具有诱导凋亡和抗肿瘤作用，提示 SAA作为靶向 AML的抗肿瘤药物具有良好的研究前景。

目录

声明

引言

1研究内容及技术路线

1.1研究内容

1.1.1 研究SAA在AML细胞株中对细胞生长、凋亡的影响

1.1.2 研究SAA作用下对线粒体凋亡通路中关键蛋白分子的影响

1.1.3 研究SAA是否通过抑制PI3K/Akt途径在AML细胞中发挥作用及其潜在作用靶点

1.1.4 利用裸鼠皮下成瘤技术构建AML小鼠模型研究在体环境下SAA对AML肿瘤细胞生长的影响

1.1.5 在AML原代肿瘤细胞及非恶性增殖性疾病患者的BMMCs中进一步验证SAA的抗肿瘤作用

1.2技术路线

1.2.1 明确 SAA 在 AML 不同细胞株中对细胞生长、凋亡的作用，同时探究 SAA 对PI3K/Akt信号通路的调控作用

1.2.2 在体实验进一步验证SAA对体内AML细胞的抗肿瘤作用

1.2.3 在原代AML细胞中验证SAA的抗肿瘤作用，并与SAA对骨髓正常单个核细胞的作用相比较

2实验材料及研究方法

2.1实验材料

2.1.1 丹酚酸A

2.1.2 细胞株

2.1.3 裸鼠 (BALB/c ASlac-nu)

2.1.5 主要的仪器设备

2.1.6 主要试剂

2.2实验方法

2.2.1 丹酚酸A的溶解与稀释

2.2.3 MTS法检测细胞生长

2.2.4 细胞凋亡检测

2.2.5 蛋白印记

2.2.6 裸鼠皮下成瘤实验构建AML动物模型

2.2.7 骨髓原代细胞分离

2.2.8统计分析

3实验结果

3.1 SAA以浓度依赖的方式抑制AML细胞活性

3.2 SAA诱导AML细胞凋亡

3.3 SAA诱导AML细胞中PARP降解及caspase-3活化，并伴随Bcl-2家族中蛋白的表达异常

3.4 SAA抑制AML细胞中PI3K/Akt信号通路的活性

3.5 SAA抑制在体肿瘤中AML细胞的生长速度

3.6 SAA诱导AML原代细胞凋亡

4讨论

5. 结论

参考文献

附录A 缩略词

在学研究成果

致谢