microRNA在急性白血病的分类和预后作用及在高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病细胞凋亡中的作用机制

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：microRNA在急性白血病中的分类及预后中的作用
　　 目的：
　　 观察23种前体miRNAs在85例初发未治急性白血病中的表达，探讨miRNAs在急性白血病中分类及与预后的关系。
　　 方法：
　　 采用逆转录实时荧光定量PCR技术检测23种miRNAs在初发未治急性白血病患者骨髓单个核细胞中的表达，并对患者的生存期进行随访。
　　 结果：
　　 ①16个miRNAs在85例AML与ALL中差异表达，9种miRNAs在ALL中表达明显高于AML，而7种miRNAs在AML表达明显高于ALL。②32例ALL患者中miR-146a、miR-181a/c和miR-221与ALL患者的总生存期相关：miR-146a、miR-181a/c高表达的患者的生存期短，而miR-221高表达患者有更长的生存期。③5种miRNAs表达水平与53例AML患者生存期有显著相关。miR-25的表达水平与生存期呈正相关，另4种表达水平与生存期呈负相关。对其中的40例非M3亚型的AML病例进行分析，3种miRNAs的表达水平与生存期均呈负相关。④考虑到miR-146a是我们研究的23个miRNAs中唯一一个与AML和ALL患者总生存期相关的miRNA，追加检测了61例初发未治AML患者骨髓标本miR-146a，结果显示miR-146a低表达患者生存期长。⑤通过检索国际上5个主要的miRNA靶基因数据库，我们发现miR-146a共有约7200个可能的靶基因。
　　 结论：
　　 ①9种miRNAs在ALL中表达明显高于AML;而7个miRNAs在AML表达明显高于ALL。
　　 ②miR-146a、miR-181a/c高表达的ALL患者的生存期短，而miR-221高表达的ALL患者生存期长。
　　 ③miR-25的表达水平与AML患者生存期呈正相关，miR-26a、miR-29b、miR-146a、miR-196b表达水平与AML患者生存期呈负相关。miR-26a、miR-29b、miR-146a的表达水平与非M3亚型的AML患者生存期均呈负相关。
　　 ④在基因本体论生物过程部分，与被预测的27901个人类可能受miRNA调控的基因相比，622个miR-146a的可能靶基因中与负性调控生物学过程、阴性调控细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞周期关卡、细胞周期停滞和DNA损害检查点相关的基因比例明显提高。miR-146a高表达的患者临床预后相对差，可能与miR-146a高表达后抑制了靶基因表达有关。
　　 第二部分：microRNA在高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病细胞凋亡中的作用机制
　　 目的：
　　 探讨microRNA在高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病细胞凋亡中表达变化，并初步探讨其作用机制。
　　 方法：
　　 采用MTT比色法研究HHT对K562、HL60、U937细胞的体外生长抑制作用；采用流式细胞仪PI染色检测细胞周期和Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡；采用miRNA芯片技术检测HHT作用K562细胞后miRNA表达的变化；采用real-time PCR技术检测HHT对K562、HL60、U937细胞成熟miRNA表达的影响；采用real-time PCR技术检测HHT对K562、HL60、U937细胞及原代AML细胞miR-17-92表达的影响；采用real-time PCR技术检测HHT对K562、U937细胞C-Myc和p21mRNA表达水平的影响；采用Western Blot技术检测K562和U937细胞miR-17-92基因簇相关基因蛋白水平表达；采用Western Blot技术检测HHT作用K562细胞后bcr/abl P210蛋白和Bcl-2家族蛋白水平表达变化。
　　 结果：
　　 ①HHT抑制人AML细胞株K562、HL60、U937细胞的生长，均呈浓度和时间依赖性。②HHT对K562细胞无明显的周期抑制作用，HHT能诱导K562、HL60、U937细胞凋亡，并呈浓度依赖性。③共检测了600多个人miRNAs表达变化，发现有13种miRNAs在HHT作用后3个时间点均表达下调，与对照组相比差异大于1.5倍，未发现3个时间点均表达上调的miRNA。进一步通过real-time PCR验证，HHT能下调K562、HL60、U937细胞13种成熟miRNA的表达。④HHT能明显下调K562、HL60、U937和3例原代AML细胞miR-17-92基因簇的初级转录本表达。⑤HHT下调K562、U937细胞C-Myc mRNA表达，并上调p21mRNA表达。⑥HHT能下调K562、U937细胞P-AKT和c-Myc蛋白的表达，上调p21、PTEN、P-PTEN和E2F1蛋白的表达，而BIM和总AKT则无明显变化。⑦HHT作用K562细胞24h后，bcr/abl P210蛋白表达才明显下调，而促凋亡蛋白Bak、Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-l表达下调。
　　 结论：
　　 ①HHT可以抑制人AML细胞株细胞的增殖并诱导细胞凋亡。
　　 ②HHT能下调人AML细胞13种miRNA的成熟体表达，其下调miR-17-92基因簇miRNA表达是先通过下调c-Myc表达，进而下调miR-17-92基因簇的前体转录本表达实现的。HHT作用24h后才明显下调K562细胞bcr/ablP210蛋白表达，说明HHT下调K562细胞的c-Myc表达可能并不通过bcr/abl P210融合蛋白。
　　 ③HHT上调AML细胞miR-17-92基因簇及其两个旁系同源体的共同靶基因p21、PTEN、和E2F1蛋白表达，并抑制PTEN下游AKT磷酸化，上调p21蛋白表达可能与p21mRNA表达上调有关。这些靶基因表达上调可能与HHT下调miR-17-92基因簇及其两个旁系同源体的相关miRNAs表达有关。
　　 ④HHT还可以通过上调K562细胞的Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bak、Bax表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1表达诱导AML细胞凋亡。
　　 第三部分 miR-17-92基因及miR-17、miR-20a的类似物和抑制剂转染及作用机制
　　 目的：
　　 通过基因转染进一步研究miR-17-92、miR-17、miR-20a在HHT诱导AML细胞凋亡中的作用机制。
　　 方法：
　　 通过逆转录病毒载体将miR-17-92基因转染进入K562和U937细胞；采用电转法分别将miR-17和miR-20a的模拟物和抑制剂转染进入K562细胞；采用Western Blot技术检测相关靶基因表达变化；采用real-time PCR技术检测p21基因表达变化及miRNA表达变化；采用Annexin V/PI双染色方法检测HHT对转染后细胞凋亡影响。
　　 结果：
　　 ①转染miR-17-92基因后，与对照细胞相比，K562和U937细胞的p21、E2F1和PTEN蛋白表达下调，p21mRNA表达下调。50ng/ml HHT处理转染了miR-17-92基因的K562和U937细胞24h后，与对照细胞相比，转染后细胞早期凋亡细胞比例明显下降。②K562细胞转染miR-17和miR-20a的模拟物后，与对照细胞相比，转染后p21、E2F1和PTEN蛋白表达下调，p21mRNA表达下调。K562细胞转染miR-17和miR-20a的抑制剂后，与对照细胞相比，p21、E2F1和PTEN蛋白表达上调，p21mRNA表达上调。50ng/ml HHT处理K562细胞24h后，与对照细胞相比，转染miR-17/miR-20a模拟物后K562细胞早期凋亡比例明显下降，转染miR-17/miR-20a抑制剂后K562细胞早期凋亡比例明显上升。
　　 结论：
　　 ①在K562和U937细胞中，p21、E2F1和PTEN是miR-17-92基因簇的靶基因。
　　 ②在K562细胞中，p21、E2F1、PTEN表达分别受miR-17和miR-20a调节，是miR-17和miR-20a的靶基因。
　　 ③结合第二部分结果，说明HHT先下调了AML细胞的miR-17-92基因的表达，进而降低了miR-17和miR-20a的表达，导致靶基因p21、E2F1、PTEN表达上调，从而促进AML细胞凋亡。
　　 ④提高miR-17-92、miR-17、miR-20a表达均可抑制AML细胞对HHT的敏感性；抑制miR-17或miR-20a功能可促进AML细胞对HHT的敏感性。
　　 总结：
　　 HHT能诱导人AML细胞凋亡并下调AML细胞13种miRNAs表达。HHT下调AML细胞miR-17-92基因簇的正向转录因子C-Myc蛋白的表达，导致miR-17-92基因簇表达下调。miR-17-92基因簇表达下调导致miR-17、miR-20a低表达。HHT通过降低miR-17、miR-20a等miRNA表达，上调了其靶基因p21、E2F1、PTEN表达，进而诱导AML细胞凋亡。因而我们认为miR-17-92基因簇及其两个旁系同源体的一些miRNAs，共同通过靶基因p21、E2F1、PTEN介导HHT诱导人AML细胞凋亡，国内外未见相关的报道。

目录

文摘

英文文摘

致谢

前言

缩略语

第一部分 MICRORNA在急性白血病中的分类及预后中的作用

1.1 引言

1.2 材料和方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结

第二部分 MICRORNA在高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病细胞凋亡中的作用机制．

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三部分 MIR-17-92基因及MIR-17、MIR-20A的类似物和抑制剂转染及机制研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

结论

参考文献

综述 microRNA在人类血细胞发育和白血病中的作用

作者简历及在学期间所取得的科研成果