高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病SHI-1细胞凋亡及对MiR-143、DNMT3A、PTEN基因表达的研究

摘要

急性髓系白血病(AML)为血液系统恶性肿瘤性疾病,目前临床上治疗方法以化学药物治疗为主。虽然大多数AML患者接受强化治疗能达到完全缓解,但是复发的概率仍然很高,五年总生存率低,使之成为严重危害人类健康的恶性疾病之一。急性单核细胞白血病(AML-M5)是急性髓系白血病的一种难治特殊亚型,治疗效果较差。本课题组前期研究从我国特有植物三尖杉属海南粗榧中提取分离出的生物碱高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)对急性髓系白血病细胞增殖信号PI3K/Akt的靶向作用以及急性髓系白血病细胞凋亡的途径出发,发现HHT具有能够体外抑制急性早幼粒细胞白血病(AML-M3)细胞株NB4生长的作用,并可在一定范围内可以诱导细胞凋亡,凋亡率呈剂量依赖性。基于此结果,本研究分别用不同浓度诱导AML-M5-SHI-1细胞凋亡,进一步通过测定相关基因等变化探究HHT诱导SHI-1细胞凋亡可能的机制,为此后急性髓系白血病的靶向治疗和联合治疗提供依据。
　　目的研究高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)作用于急性单核细胞白血病(AML-M5)SHI-1细胞株的机制,是否可抑制AML-M5细胞的增殖、诱导细胞凋亡;了解HHT对AML-M5 SHI-1细胞膜电位的影响,即其诱导的细胞凋亡是否通过线粒体介导的细胞凋亡途径实现。以及HHT对miRNA-143、DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase3A,DNMT3A)、PTEN基因表达的影响,初步探讨miRNA-143、DNMT3A与PTEN-PI3K/Akt信号传导通路的关系
　　方法将不同浓度(5、10、50、100、500μg/L)的HHT作用SHI-1细胞,瑞氏染色观察细胞镜下形态学改变、流式细胞术Annexin V/PI法检测细胞凋亡、CCK-8法测细胞增殖抑制作用、线粒体膜电位试剂盒(线粒体染料JC-1活细胞染色)检测线粒体跨膜膜电位(Δψm)变化。茎环逆转录实时定量PCR及RT-PCR法检测细胞PTEN、DNMT3A基因mRNA及miR-143在药物作用前及不同浓度药物作用下表达。
　　结果 HHT能有效抑制SHI-1细胞的增殖、诱导其凋亡,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率、增殖抑制率明显增加(P<0.05)。流式细胞仪线粒体膜电位结果表明,HHT作用后存在明显荧光变化,细胞线粒体膜电位下降,并成浓度相关性。HHT药物干预前后SHI-1细胞株miR-143、DNMT3A及PTEN基因mRNA表达有明显变化。其中 miRNA-143在处理前肿瘤细胞中表达低于普通对照细胞,在凋亡细胞中表达增高,其表达量与其靶基因DNA甲基转移酶3A表达水平呈负相关。PTEN基因mRNA在药物处理前表达低,处理后表达高,且与药物浓度呈一定相关性,其结果与 miRNA-143表达检测结果相平行。HHT能有效抑制 SHI-1细胞的增殖、诱导其凋亡,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率、增殖抑制率明显增加(P<0.05)。流式细胞仪线粒体膜电位结果表明,HHT作用后存在明显荧光变化,细胞线粒体膜电位下降,并成浓度相关性。HHT药物干预前后SHI-1细胞株miR-143、DNMT3A及PTEN基因mRNA表达有明显变化。其中miRNA-143在处理前肿瘤细胞中表达低于普通对照细胞,在凋亡细胞中表达增高,其表达量与其靶基因 DNA甲基转移酶3A表达水平呈负相关。PTEN基因mRNA在药物处理前表达低,处理后表达高,且与药物浓度呈一定相关性,其结果与miRNA-143表达检测结果相平行。
　　结论 HHT可抑制AML-M5 SHI-1细胞株的增殖、诱导其凋亡,其诱导细胞凋亡可能是通过线粒体介导的细胞凋亡途径实现的。miRNA-143调控DNMT3A的表达,推测 miRNA-143与 PTEN-PI3K/pAKT信号转导途径可能有一定关联性,引起一系列信号转导通路异常活化。

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1.前言

2.材料与试剂

2.1实验器材

2.2细胞株

2.3实验试剂

3.实验原理与方法

3.1细胞培养技术

3.2台盼蓝实验

3.3 瑞氏染色细胞形态学观察

3.4 Annexin-V流式细胞仪分析

3.5 增殖能力CCK-8法检测

3.6 线粒体跨膜电位(Δψm)检测

3.7 RT-PCR法提取目标基因cDNA

3.8 引物设计与合成

3.5实时定量PCR（RT-PCR）测目标mRNA（GAPDH、DNMT3A、PTEN）mRNA及miRNA-143的表达：

3.6 统计学处理

4.结果

4.1 HHT处理前后瑞氏染色细胞形态学观察

4.2 HHT对SHI-1细胞凋亡的影响

4.3 HHT对SHI-1细胞的增殖抑制

4.4 HHT作用细胞后线粒体膜电位变化

4.5 HHT作用后MiRNA-143及其靶基因DNMT3A、PTEN基因的mRNA表达量

5.讨论

6.结论

参考文献

附录

致谢

综述