伏隔核miR-206对线索诱导的大鼠海洛因复吸行为的调控

摘要

目的：海洛因成瘾是一种以易复发为特征的慢性脑病，研究表明海洛因成瘾的发病学基础是海洛因长期暴露后所致的大脑结构与功能的适应性改变：如与学习和记忆环路的受损以及脑内神经元可塑性和信号分子的表达改变。迄今为止，针对海洛因依赖者的治疗手段主要仍是控制阿片戒断综合症，但缺乏有效的抗海洛因复吸措施。如果能寻找到较特异的生物标记物，可以指导和有效干预复吸行为。miRNA是一类长约22个核苷酸大小的非编码 RNAs，可以调控靶基因的翻译，与药物成瘾密切相关，目前关于 miRNA与海洛因复吸行为之间的神经生物学机制研究比较少。本课题选择 miR-206为目标深入探索它对海洛因复吸行为的影响，同时系统观察它对相关靶基因表达影响旨在明确伏隔核 miR-206在大鼠海洛因复吸行为中的主要调控机制。
　　实验结果：
　　实验一：通过基因芯片分析海洛因大鼠的伏隔核 miRNA表达谱，完成 miRNA的筛选和靶向分析
　　SD雄性大鼠进行连续14天的海洛因自身给药训练（FR1，海洛因浓度0.05 mg/injection/kg）。实验大鼠分3组：空白对照组（Control，n=3）、戒断1天后线索诱导复吸组（CS1，n=3）、戒断14天后线索诱导复吸组(CS14,n=3)。CS1组和 CS14组分别于戒断1天和戒断14天后行线索诱导复吸行为测试，在行为测试结束后迅速断头取脑部伏隔核组织，3组样本统一送基因公司进行 miRNA表达谱分析，完成基因芯片的筛选工作，本实验重点遴选戒断后表达增加的miRNA。
　　targetscan靶向分析方法：通过在线数据库：miRbase,Targetscan, miRWalk, microcosm Targets等数据库，搜索 miR-206结合的靶基因，查阅文献了解靶基因的相关作用。
　　结果：通过基因芯片技术,得到一系列 miRNA的表达谱，从中挑选出在 CS1d与 CS14d表达有差异的 miRNA，参阅大量文献，选择研究对象 miR-206。通过分析确定 miR-206目标蛋白为 BDNF/MeCP2/GABBR1。
　　实验二：验证海洛因成瘾大鼠伏隔核 miR-206的表达
　　方法：实验大鼠分3组：空白对照组（Control，n=4）、戒断1天后线索诱导复吸组（CS1，n=4）、戒断14天后线索诱导复吸组(CS14,n=4)，Control组于戒断第1天断头取伏隔核组织， CS1组大鼠于海洛因戒断第1天测复吸行为后断头取脑部伏隔核， CS14组大鼠于戒断14天后测复吸行为断头取脑部伏隔核提取 RNA，通过 qRT-PCR实验技术验证 miR-206的表达与基因芯片的分析结果是否一致。
　　结果：单因素方差分析发现， qRT-PCR实验结果中 miR-206的表达在组间有统计学差异（F（2,10）=5.44，P<0.05)。相比于 Control组，CS1组大鼠伏隔核的miR-206表达明显增加(P<0.05)；与 CS1组相比，CS14组的大鼠伏隔核处 miR-206的表达明显升高（P<0.05）。此实验结果与基因芯片分析的 miR-206表达谱一致。
　　实验三：观察海洛因成瘾大鼠的伏隔核不同程度表达 miR-206-3p对线索诱导的大鼠复吸行为的影响，并检测目的蛋白的表达
　　方法：将成功建立海洛因自身给药的34只海洛因大鼠根据有效鼻触随机分为4组:14天戒断的线索诱导复吸组（CS14， n=8），阴性对照组（LV-GFP,n=8）， miR-206过表达组（LV-miR-206-3p,n=9）， miR-206低表达组（LV-miR-206-3p inhibition,n=9），借助大鼠脑立体定位技术，分别于自身给药训练结束后的2天内将 LV-GFP、 LV-miR-206-3p、LV-miR-206-3p inhibition慢病毒注入对应组别大鼠的伏隔核部位，术后连续给予3天青霉素（I.m，qd，400000 U/kg），戒断14天后4组大鼠统一进行2小时的线索诱导复吸行为测试，观察 miR-206-3p不同程度的表达对大鼠海洛因复吸行为的影响。随后断头取脑部伏隔核，通过 qRT-PCR实验检测 miR-206-3p的表达水平（每组4-5只），应用 Western blot实验检测 BDNF/MeCP2/GABBR1的表达。
　　结果：单因素方差分析发现，组间有效鼻触有统计学差异（F（3,32）=3.42， P<0.05)，而无效鼻触没有统计学差异（P＞0.05)。两两比较显示， LV-miR-206-3p inhibition组的有效鼻触相比 LV-GFP组显著增加（P<0.05）。qRT-PCR实验中 miR-206的表达在组间有统计学差异（F（3,13）=30.86，P<0.05)。于此同时，单因素方差分析发现各组间 BDNF的表达水平(F（2.12）=29.75， P<0.05)、MeCP2的表达水平（F（2.12）=3.90，P<0.05）和 GABBR1蛋白表达水平（F（3,14）=46.96， P<0.05)均有统计学差异。与 LV-GFP组比较， LV-miR-206-3p inhibition组 BDNF和 MeCP2表达水平均明显增加(P<0.05)，而 GABBR1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。
　　实验四：抑制伏隔核 miR-206-5p的表达对线索诱导大鼠复吸行为的影响
　　方法：成功建立24只海洛因成瘾大鼠,根据有效鼻触随机分为3组:14天戒断的线索诱导复吸组（CS14，n=8），阴性对照组（LV-GFP,n=8），miR-206-5p抑制组（LV-miR-206-5p inhibition,n=8），借助大鼠脑立体定位技术，于成瘾训练结束后1天内将 LV-miR-206-5p inhibition、LV-GFP病毒注入对应组别大鼠的伏隔核部位，术后进行连续3天的青霉素肌注（400000 U/kg），戒断14天后3组大鼠统一进行2小时的线索诱导复吸行为测试，观察大鼠海洛因复吸行为的变化。
　　结果：通过线索诱导的行为学测试发现伏隔核低表达 miR-206-5p对大鼠有效鼻触数没有统计学差异（F（2.22）=0.97,P＞0.05），表明对复吸行为并无明显调控作用。
　　实验五：大鼠伏隔核部位消减 Gabbr1对海洛因复吸行为的影响
　　方法：成功建立26只大鼠海洛因成瘾模型，根据有效鼻触随机分为3组：戒断14天线索诱导复吸组（CS14， n=8），阴性病毒组（LV-GFP,n=9）， Gabbr1表达抑制组（LV-siRNA-Gabbr1,n=9）；LV-GFP组和 LV-siRNA-Gabbr1组均于戒断2天内在伏隔核微注射相应的慢病毒载体，3组大鼠统一在戒断14天后进行 CS2h的复吸测试，并灌流脑组织，观察病毒转染效率。
　　结果：通过 CS2h的行为学测试发现伏隔核低表达 Gabbr1对大鼠有效鼻触数没有统计学差异(F（2.24）=1.20,P＞0.05)，表明对大鼠海洛因复吸行为并无调节作用。
　　实验六：对海洛因成瘾的大鼠伏隔核过表达 MeCP2，观察其复吸行为变化
　　方法：成功建立24只大鼠海洛因成瘾模型，据有效鼻触随机分成3组：戒断14天诱导复吸组（CS14，n=8），阴性病毒组（LV-GFP,n=8），MeCP2过表达组（LV–MeCP2,n=8），LV-GFP组和 LV-MeCP2组均于戒断第1天通过立体定位技术，在伏隔核处注入等量的慢病毒。3组大鼠在戒断14天后统一进行 CS2h复吸测试，并断头取伏隔核组织，分别进行后续的 qRT-PCR及 Western-blot实验。
　　结果：单因素方差分析发现，成瘾大鼠各组间有效鼻触有统计学差异（F(2,22)=3.57,P<0.05），无效鼻触没明显差异（P＞0.05）,各组间 BDNF的表达水平有统计学差异(F（2.12）=25.65，P<0.05)，各组间 MeCP2的表达水平亦有统计学差异（F（2.12）=11.01，P<0.05）。与 LV-GFP组比较，LV- MeCP2组的 BDNF和MeCP2表达水平均明显增加(P<0.05)。
　　实验七：双荧光素酶实验检测 miR-206与 MeCP2基因的调控关系
　　方法：实验分为6组：control+miRNA-206、control+miRNA-206-NC、MeCP2WT+miRNA-206、 MeCP2WT+miRNA-206-NC、 MeCP2MU+miRNA-206以及MeCP2MU+miRNA-206-NC；将0.1μgMeCP2基因的质粒（control， MeCP2WT， MeCP2mutant）、0.4μg miRNA-206质粒（miRNA-206和 miRNA-206NC）和0.02μg Renilla质粒通过 ROCHE试剂盒转染于293T细胞，转染48h后，Promega检测各组荧光值。观察 miR-206对MeCP2WT组荧光蛋白表达的影响。
　　结果：MeCP2WT+miRNA-206组和 MeCP2WT+miRNA-206-NC组的荧光表达量比较有所减少（P=0.025）。结果提示 miR-206可直接部分抑制 MeCP2基因的表达。
　　结论：
　　本研究发现海洛因成瘾戒断14天后伏隔核 miR-206的表达升高，而抑制miR-206后大鼠海洛因复吸行为增强，结果提示戒断后伏隔核 miR-206的表达对海洛因复吸行为具有保护性作用。
　　通过对预测的 miR-206调控的目的基因进行验证分析，表明 miR-206对BDNF和 MeCP2的表达有调控作用；抑制 miR-206后 MeCP2表达增高，双荧光素酶实验发现 miR-206轻度调控 MeCP2的表达，因此， miR-206可能靶向调节BDNF和 MeCP2的表达起到对复吸行为的保护作用。

目录

声明

引言

1材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验物品及试剂

1.3 各溶液配制

1.4 实验常用仪器

1.5 实验方法

2实验安排

2 . 1 实验一 基因芯片分析大鼠伏隔核的miRNA 表达谱，完成目标miRNA-206的筛选和靶向分析

2.2实验二 验证海洛因成瘾大鼠伏隔核miR-206表达

2 . 3 实验三 观察海洛因成瘾大鼠的伏隔核不同程度表达miR-206-3p对线索诱导大鼠复吸行为的影响，并检测目的蛋白表达

2.4实验四 伏隔核抑制 miR-206-5p 的表达对线索诱导的大鼠复吸行为的影响

2.5实验五 大鼠伏隔核部位消减Gabbr1对海洛因复吸行为的影响

2.6实验六 在海洛因成瘾的大鼠伏隔核部位过表达 MeCP2，观察其复吸行为变化

2.7实验七 双荧光素酶实验检测miR-206与MeCP2基因的调控关系

3实验结果：

3.1实验一 通过基因芯片分析大鼠伏隔核 miRNA 表达谱，完成 miRNA-206的筛选和Targetscan靶向分析

3.2实验二 验证海洛因成瘾大鼠的伏隔核miR-206的表达

3.3实验三 海洛因成瘾大鼠伏隔核不同程度表达miR-206-3p 对线索诱导的复吸行为和蛋白表达的影响

3.4实验四 伏隔核抑制miR-206-5p的表达对线索诱导大鼠复吸行为的影响

3.5实验五 大鼠伏隔核部位消减Gabbr1对复吸行为的影响

3.6实验六 对海洛因成瘾的大鼠伏隔核过表达MeCP2，观察其复吸行为变化

3.7实验七 双荧光素酶实验检测miR-206与MeCP2基因的调控关系

4讨论

5结论

参考文献

附录A缩写词及中英文对照表

在学研究成果

致谢

附录B 文献综述:苯丙胺类兴奋剂依赖的临床治疗的进展

PROGRESS IN CLINICAL TREATMENT OF ATS DEPENDENCE