非小细胞肺癌尿液游离miRNA液态活检及其临床意义

摘要

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的发病率及死亡率位居在中国及世界首位，复发转移是患者死亡的主要因素。NSCLC恶性程度高，目前临床上缺乏针对其有效的早期筛查及诊断方法，大部分患者就诊时就已经为晚期。因此，寻找有效的肺癌相关的早期诊断的标志物对于国民健康具有重要意义。MicroRNAs(miRNAs)是一类具有调控基因表达功能的生物小分子，其中一些 miRNAs在肿瘤发生发展过程中扮演癌基因或抑癌基因的角色，对肿瘤的早期诊断、治疗、预后判断具有重要的临床意义。液态活检(liquid biopsy)是通过应用灵敏的分子生物学技术检测体液(血浆、血清、尿液、唾液、胸水、腹水)中与疾病发生、发展高度相关的特异性分子标志物，为疾病的筛查、早期诊断、药物选择、疗效监测、预后评估等方面提供无创性的方法。近年来，液态活检在肿瘤的筛查、诊断和疗效监测方面的应用取得巨大进展。液态活检在循环 miRNA作为肿瘤生物标志物的研究应用受到广泛关注。作为肿瘤标志物，循环 miRNA具有稳定、易检测及重复性好等优点，能为肿瘤的诊断和治疗提供帮助。但是，血液成分复杂，循环 miRNA易受到全血 RNA的污染，会使疾病诊断的准确性受到明显影响。尿液也是液态活检的重要研究对象；与血清或血浆相比，尿液具有组成简单、取样方便、无创、稳定、可反复取样等优点。目前，已有研究表明，尿液 miRNA可作为肿瘤标志物应用于胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌及肝癌等的早期诊断及预后评估，但对于 NSCLC尚缺乏研究。因此，本研究欲通过应用新一代 RNA深度测序技术(next-generation RNA sequencing)来探索性地寻找 NSCLC患者尿液中与肺癌相关的游离 miRNA,应用逆转录-实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)验证筛选结果，并初步探讨尿液游离 miRNA在 NSCLC早期诊断中的意义。
　　本研究首先应用小 RNA深度测序的方法对4例 NSCLC患者和2例健康人尿液进行探索性研究，筛选出10种表达水平显著高于对照组的尿液游离 miRNA(miR10a, miR-10b, miR-155, miR-191, miR-192, miR-196a, miR-21, miR-224, miR-26a, miR-98)。随后，我们选取43例 NSCLC首诊患者和26例健康人尿液样本用 RT-qPCR方法对上述10种尿液游离 miRNA进行验证。结果显示，NSCLC患者尿液中6种 miRNA(miR-10a, miR-10b, miR-191, miR-192, miR-21, miR-26a)的水平显著高于健康人(p＜0.01)；而 NSCLC患者尿液 miR-155的水平显著低于正常组(p＜0.01)；NSCLC患者尿液中 miR-196a，miR-224和 miR-98在NSCLC患者和健康组中无显著性差异。受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线显示 miR-26a，miR-21，miR-191，miR-192，miR-10a，miR-10b，miR-155及 miR-21:miR-155比值的曲线下面积(area under the curve, AUC)分别是0.901(0.829,0.974)，0.842(0.755,0.929)，0.753(0.633,0.873)，0.746(0.621,0.870)，0.679(0.551,0.807)，0.735(0.615,0.855)，0.699(0.568,0.831)和0.872(0.787,0.956)；其中， miR-21:miR-155比值用于NSCLC诊断的灵敏度和特异性最高，分别为86%和84.6%。二元 Logistic回归分析显示联合7种尿液游离 miRNA(miR-10a, miR-191, miR-192, miR21, miR26a, miR-10b, miR-155)检测对 NSCLC的诊断效率明显高于单个 miRNA，其 AUC为0.927(0.864,0.989)，灵敏度和特异性分别为92.3%和83.7%。
　　综上，本研究结果表明联合7种尿液游离 miRNA(miR-10a, miR-191, miR-192, miR21, miR26a, miR-155, miR-10b)检测可作为生物标志物用于 NSCLC的辅助诊断。

目录

声明

引言

1研究内容和实施方案

1.1研究内容

1.2实施方案

2实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验样本收集及基本信息

2.1.2主要试剂及耗材

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1尿液样本收集及总RNA提取

2.2.2小RNA深度测序

2.2.3逆转录荧光定量PCR (RT-PCR)

2.2.4统计分析

3实验结果

3.1非小细胞肺癌尿液差异游离miRNA的发现

3.2非小细胞肺癌尿液差异游离miRNA的RT-qPCR验证

3.3 ROC诊断标志物分析

4讨论

5结论

参考文献

附录A 综述:循环miR-155作为肿瘤生物标志物的研究进展

在学研究成果

致谢