褪黑素对大鼠重症急性胰腺炎肾脏损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的:观察重症急性胰腺炎大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),肾脏组织Livin蛋白和Caspase-9表达的变化,以探讨褪黑素对重症急性胰腺炎(SAP)相关肾脏损伤的保护作用及相关机制。
　　 方法:雌性SD大鼠90只,随机分为正常对照组(NC组)(12H、24H、48H组分别各10只),模型组(SAP组)(12H、24H、48H组分别各10只),褪黑素组(MT组)(12H、24H、48H组分别各10只)。大鼠术前12H禁食,自由饮水。3％的戊巴比妥钠按40mg/kg妇的剂量经腹腔注射麻醉。常规消毒,铺巾,在无菌操作下做上腹正中切口3cm左右,打开腹腔,找到胃十二指肠交界处,再向下寻找到胰胆管十二指肠开口处。用丝线结扎(活结)近肝门处胰胆管,用4.5号头皮针于十二指肠乳头附近经十二指肠肠壁穿刺,逆行插入胰胆管,并在十二指肠乳头处用手指捏住胰管末端。按1ml/kg将5％牛磺胆酸钠逆行匀速推注至胰管中(0.2ml/min),使整个胰胆管均匀隆起。退出针头,即用手压迫进针处约3～5min,然后去除结扎线,关腹,并同时开始计时观察。正常对照组开腹后翻动肠壁即关腹。褪黑素组在术后10分钟用褪黑素溶液于大鼠背部皮下注射3ml。褪黑素按照文献数据选取大剂量(50mg/kg)。MT先被无水乙醇溶解,再用生理盐水稀释,使乙醇的终浓度为1％。模型组大鼠采用同样方法给予等量的1％乙醇溶液。用全自动生化分析仪测定大鼠血清淀粉酶,肌酐(Cr),尿素氮(BUN)；用硫代巴比妥法测定MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力；免疫组化法检测肾组织Livin和Caspase-9的表达；原位末端标记法(TUNEL)检测肾脏细胞凋亡率。
　　 结果:1.胰腺的病理改变:正常对照组大鼠胰腺组织大体所见未见明显病变。SAP造模组大鼠胰胆管逆行注入5％牛磺胆酸钠后,胰管周围胰腺组织颜色立即变红,并逐渐扩展、加深。SAP造模12H后再次剖腹发现胰腺颜色紫暗,充血水肿明显,可见局部坏死及出血,腹水明显,呈淡红色。褪黑素组大鼠12H后剖腹见胰腺颜色变暗,充血水肿,但较模型组程度轻,未见明显坏死、出血,有少量腹水。SAP造模24H后,剖腹可见腹腔内大量淡红色腹水,胰腺与周围脏器粘连严重,表面可见多处出血点及坏死灶。褪黑素24H干预组剖腹观察,大鼠腹腔内可见腹水,胰腺与周围组织轻度粘连,胰腺水肿,色泽紫暗,胰腺及网膜组织多处皂化斑。SAP造模48H后,剖腹可见腹腔内大量血性腹水,胰腺与周围脏器粘连严重,表面可见多处出血点、坏死灶及皂化斑。褪黑素48H干预组剖腹观察,大鼠腹腔内可见腹水,肠管淤胀,胰腺与周围组织轻度粘连,胰腺水肿,色泽紫暗,胰腺及网膜组织多处皂化斑。光镜下观察:正常组胰腺组织结构完整,间质无炎细胞浸润。SAP模型12H组可见胰腺叶间隔、小叶间隙、腺泡间隔增宽及少量炎细胞浸润；褪黑素12H干预组胰腺小叶间隙增宽、少量炎细胞浸润,较胰腺炎组程度轻。SAP模型24H组时胰腺损伤较显著,胰腺腺泡肿胀、出血、小叶内和小叶外周局灶或片状坏死,间质可见较大量炎细胞浸润、部分腺叶正常结构消失。褪黑素24H干预组胰腺间质疏松水肿,小叶小片状坏死,间质有炎细胞浸润,小叶结构相对清晰。SAP模型48H组时胰腺损伤已经十分显著,表现为胰腺腺泡极度肿胀、出血、小叶内和小叶外周局灶或片状坏死,间质可见大量炎细胞浸润、部分腺叶正常结构消失。褪黑素48H干预组胰腺间质疏松水肿,可见红细胞渗出、小叶小片状坏死,间质有炎细胞浸润,小叶结构相对清晰。2.肾脏组织病理改变:正常对照组大鼠肾脏组织大体所见未见明显病变。SAP模型组12H时肾脏外观轻度水肿,呈暗紫色；24H时肾脏充血水肿加重,并可见少量出血点。48H时肾脏充血水肿严重,并可见大量出血点。褪黑素干预组各时间点肾脏病理改变均较SAP组减轻。光镜观察结果:正常对照组未见异常。各时点肾皮质、髓质结构清晰,肾小管、肾小球结构正常。SAP组12H时肾小球轻度肿胀,肾小管肿胀较为明显,肾间质见炎细胞浸润；24H时肾小球、肾小管肿胀加重,肾小管上皮细胞可见坏死,肾间质炎细胞增多。48H时肾小球、肾小管肿胀严重,肾小球可见淤血,肾小管上皮细胞可见坏死,肾间质大量炎细胞,可见管型。褪黑素干预组各时间点光镜下所见病理改变均较SAP组减轻。3.生化指标:SAP造模组各时间点的血清AMY、Cr、BUN及MDA含量较正常组各相应时间点显著升高(P<0.01)；SAP造模组各时间点的SOD活性较正常组各相应时间点显著降低(P<0.01)。与SAP造模组比较,褪黑素干预组各时间点的血清AMY、Cr、BUN及MDA含量显著降低(P<0.05)；SOD活性显著升高(P<0.01)。4.凋亡相关指标:SAP造模组各时间点Livin蛋白阳性率较正常组各相应时间点Livin蛋白阳性率降低(P<0.01),Caspase-9阳性率较正常组各相应时间点升高(P<0.01)；与SAP造模组比较,褪黑素干预组各时间点Livin蛋白阳性率升高(P<0.05),Caspase-9阳性率降低(P<0.05)。5.相关性分析:5.1SOD、MDA与肾功能损害的相关性分析结果:SOD与血清Cr呈负相关(r=-0.916,P<0.01),MDA与血清Cr呈正相关(r=0.807,P<0.05)。5.2SOD、MDA与凋亡的相关性分析:肾脏细胞凋亡率与SOD呈负相关(r=-0.827,P<0.01),与MDA呈正相关(r=0.607,P<0.05)。5.3SOD、MDA与凋亡相关蛋白Livin、Caspase-9的相关性分析:SOD与Caspase-9表达程度呈负相关(r=-0.382,P<0.05),MDA与Caspase-9表达程度呈正相关(r=0.356,P<0.05)；SOD与Livin表达无相关性(r=-0.572,P>0.05),MDA与Livin表达无相关性(r=-0.489,P>0.05)。
　　 结论:褪黑素对SAP相关肾脏损伤有保护作用,其机制可能是通过抗脂质过氧化,降低肾脏细胞凋亡来实现的。

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褪黑素对重症急性胰腺炎并发多脏器损伤治疗作用的研究(综述)

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