伏隔核调控ERK信号分子的rno-miRNA在海洛因复吸行为中的作用

摘要

目的：本研究选择ERK作为靶基因，利用自身给药大鼠模型较好的模拟人的成瘾和复吸的过程，探索相关rno-miRNA对ERK基因表达以及海洛因复吸行为的影响，并初步探讨可能的分子机制。 方法：1、本研究通过在线数据库预测并与实验室的miRNA基因芯片比对，筛选出可能调控ERK基因的rno-miRNA，并利用qRT-PCR和双荧光素酶实验在分子水平和细胞水平进行验证。 2、本研究主要通过在自身给药模型大鼠伏隔核脑区微注射rno-miR-21-5p、rno-miR-320-3p和siRNA慢病毒，感染14天之后进行2小时的海洛因线索诱导复吸行为测试，立即断头取伏隔核脑区，进行Western Blot和qRT-PCR实验分析。 结果：1、通过对比分析筛选出rno-miR-21-5p和rno-miR-320-3p与ERK2存在结合位点，细胞水平验证出两者均与ERK23`UTR结合并抑制其表达；分子水平上验证出rno-miR-21-5p在成瘾和复吸阶段表达均高于对照组，但rno-miR-320-3p在成瘾组表达高于对照组，而复吸组低于成瘾组，总体都高于对照组。 2、行为学实验结果显示，抑制rno-miR-21-5p后LV-miR-21-5p inhibition组中海洛因复吸行为升高（p＜0.05）；过表达rno-miR-320-3p后LV-miR-320-3p组中海洛因复吸行为降低（p＜0.05）；且过表达siRNA-ERK后LV-siRNA-ERK组中海洛因复吸行为降低（p＜0.01）。 3、分子水平实验结果显示，抑制rno-miR-21-5p后LV-miR-21-5p inhibition组中miR-21-5p的相对表达量降低（p＜0.05），ERK2mRNA的相对表达量并无统计学意义[F(2,23)=0.829，p=0.449]，但p-ERK蛋白的表达量升高（p＜＜0.01）；过表达rno-miR-320-3p后LV-miR-320-3p组中miR-320-3p的相对表达量上升（p＜0.01），ERK2mRNA的相对表达量没有统计学意义[F(2,16)=3.087,p=0.073]，但p-ERK蛋白的表达量降低（p＜0.01）；过表达siRNA-ERK后LV-siRNA-ERK组中ERK2mRNA表达量均显著降低（p＜0.01），p-ERK蛋白的相对表达量降低（p＜0.01）。 结论：本实验发现海洛因自身给药戒断复吸后大鼠NAc脑区中rno-miR-21-5p表达显著升高而rno-miR-320-3p表达显著降低；抑制rno-miR-21-5p后能明显增强大鼠线索诱导的海洛因复吸行为，而过表达rno-miR-320-3p则降低大鼠线索诱导的海洛因复吸行为。结果提示大鼠NAc中rno-miR-21-5p和rno-miR-320-3p的表达均介导了线索诱导的海洛因复吸过程。 通过细胞水平的双荧光素酶报告基因实验和在体siRNA干扰实验均证明，rno-miR-21-5p和rno-miR-320-3p可能共同靶向调节ERK2信号分子的表达从而参与线索诱导的海洛因复吸行为，初步探索了调控ERK2靶基因的rno-miR-21-5p和rno-miR-320-3p在海洛因复吸中作用的部分机制，并为临床寻找治疗海洛因成瘾与复吸相关的生物标志物和药物靶标提供重要的实验依据。

目录

声明

引言

1实验材料与材料制备

1.1实验动物

1.2实验试剂及配制

1.2.1主要药品与试剂

1.2.2主要试剂配制方法

1.3实验仪器及材料制备

1.3.1主要实验仪器

1.3.2主要材料及制备

1.4实验方法

1.4.1大鼠颈静脉插管手术

1.4.2稳定的海洛因自身给药模型的建立

1.4.3消退实验

1.4.4海洛因线索诱导的复吸行为测试

1.4.5脑立体定位及大鼠伏隔核脑区微注射病毒载体

1.4.6大鼠灌流取脑、切片并鉴定病毒转染情况

1.4.7蛋白提取、浓度测定及Western Blot实验

1.4.8在线数据库预测及筛选ERK相关rno-miRNA

1.4.9伏隔核脑区组织总RNA提取实验

1.4.10 逆转录及qRT-PCR实验

1.4.11 双荧光素酶报告基因实验

1.5数据统计及分析

2实验安排

2.1明确ERK蛋白在海洛因成瘾和复吸中的表达水平变化

2.2模型大鼠腹腔注射ERK抑制剂U0126对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

2.3预测并筛选调控ERK基因的目标rno-miRNA

2.4分子和细胞水平验证目标rno-miRNA

2.4.1 qRT-PCR验证

2.4.2双荧光素酶报告基因验证

2.5模型大鼠伏隔核脑区微注射抑制rno-miR-21-5p和过表达rno-miR-320-3p慢病毒对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

2.5.2过表达rno-miR-320-3p的影响

2.6模型大鼠伏隔核脑区过表达siRNA-ERK对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

3实验结果

3.1明确ERK蛋白在海洛因成瘾和复吸中的表达水平变化

3.1.1建立稳定自身给药模型

3.1.2线索诱导复吸行为测试

3.1.3明确海洛因自身给药戒断后线索诱导复吸大鼠ERK蛋白表达情况

3.2模型大鼠腹腔注射ERK抑制剂U0126对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

3.2.1腹腔注射ERK抑制剂U0126对海洛因复吸行为影响

3.2.2腹腔注射ERK抑制剂U0126对ERK蛋白表达的影响

3.3调控ERK基因的目标miRNA的预测和筛选

3.3.1目标rno-miRNA的预测

3.3.2目标rno-miRNA的筛选

3.4分子和细胞水平验证目标miRNA

3.4.1 qRT-PCR验证

3.4.2双荧光素酶报告基因验证

3.5模型大鼠伏隔核脑区过表达或抑制目标rno-miRNA对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

3.5.1大鼠灌流取脑、切片并观察病毒转染情况

3.5.2抑制rno-miR-21-5p对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

3.5.3过表达rno-miR-320-3p对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

3.6模型大鼠伏隔核脑区过表达siRNA-ERK对海洛因复吸行为及ERK蛋白表达的影响

3.6.1过表达siRNA-ERK对海洛因复吸行为影响

3.6.2 过表达siRNA-ERK 对ERK2 mRNA 及蛋白表达的影响

4讨论

5结论

参考文献

附录A 缩写词及中英文对照表

附录B 文献综述:中枢神经系统 ERK信号通路在药物成瘾中的作用机制研究进展

在学研究成果

致谢