香鱼清道夫受体MARCO的克隆鉴定及其对单核/巨噬细胞功能的调控研究

摘要

胶原样结构巨噬细胞受体（Macrophage receptor with collagenousstructure，MARCO）在吞噬细胞介导的先天免疫应答中起着重要作用。然而，关于MARCO的研究特别是对其功能的研究目前只限制于几种硬骨鱼类。本研究首次从香鱼（Plecoglossus altivelis）中克隆得到了MARCO基因，并命名为PaMARCO。PaMARCO的功能结构域与哺乳动物中同源分子高度保守，序列分析表明虹鳟（Oncorhynchus mykiss）MARCO与PaMARCO的相似度最高。在受到鳗弧菌感染后，PaMARCO在所有检测的香鱼免疫组织以及单核/巨噬细胞（MO/MΦ）中表达量均显著上调，而抗体封闭阻断PaMARCO功能后，MO/MΦ的免疫反应显著降低。体外试验证实，PaMARCO能够结合革兰氏阳性和阴性细菌并且该结合依赖于Ca2+。此外，使用抗体封闭MO/MΦ上的PaMARCO，MO/MΦ的吞噬和杀菌的活性也显著降低。进一步的研究发现，PaMARCO还参与了香鱼MO/MΦ的极化过程。抗体封闭MO/MΦ上的PaMARCO后，在LPS诱导的M1型MO/MΦ中代表性炎症细胞因子（TNF-α和IL-1β）表达上调，同时在cAMP诱导的M2型MO/MΦ中代表性抑炎细胞因子（TGF-β和IL-10）表达上调，表明PaMARCO可能同时参与了对MO/MΦ炎症反应的启动及炎症消退过程的调控。实验的研究结果表明，PaMARCO在细菌结合与清除中有重要的调节作用，并且对MO/MΦ的极化也具有重要调控作用。

目录

声明

引言

1综述

1.1清道夫受体

1.1.1清道夫受体的发现

1.1.2清道夫受体的分类

1.1.3清道夫受体的功能

1.2 A类清道夫受体家族

1.2.1 A类清道夫受体的发现

1.2.2 A类清道夫受体的结构

1.2.3 A类清道夫受体的功能

1.3 MARCO

1.3.1 MARCO的发现

1.3.2 MARCO的结构

1.3.3 MARCO的功能

2香鱼MARCO基因的克隆及其与抗菌感染的相关性

2.1材料和方法

2.1.1实验样品

2.1.2 主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4菌株和载体

2.1.5总RNA的提取及cDNA的合成

2.1.6 PCR扩增及纯化

2.1.7 T-A克隆载体构建

2.1.8感受态细胞制备

2.1.9转化

2.1.10 序列分析

2.1.11 鳗弧菌感染香鱼

2.1.12 荧光定量PCR

2.2结果

2.2.1 PaMARCO cDNA序列分析

2.2.2鳗弧菌感染后PaMARCO mRNA的表达变化

2.3讨论

3香鱼MARCO蛋白的表达及其细菌结合能力分析

3.1材料和方法

3.1.1实验样品

3.1.2主要仪器

3.1.3主要试剂

3.1.4载体和菌株

3.1.5原核表达载体构建

3.1.6 IPTG诱导表达

3.1.7重组蛋白的纯化

3.1.8抗血清制备

3.1.9Western blot验证抗血清的特异性

3.1.10 细菌结合实验

3.1.11 糖结合实验

3.2结果

3.2.1香鱼MARCO的原核表达及抗血清制备

3.2.2香鱼MARCO与细菌的结合

3.2.3香鱼MARCO 与糖类结合

3.3讨论

4香鱼MARCO对单核/巨噬细胞的调节作用

4.1材料与方法

4.1.1实验样品

4.1.2 主要仪器

4.1.3主要试剂

4.1.4实验菌株

4.1.5香鱼头肾来源MO/MΦ的分离与培养

4.1.6荧光定量PCR检测鳗弧菌感染MO/MΦ后 MARCO表达

4.1.7抗体封闭

4.1.8荧光定量PCR检测MO/MΦ细胞因子的表达

4.1.9吞噬实验

4.1.10 杀菌实验

4.1.11 极化实验

4.2结果

4.2.1鳗弧菌感染后PaMARCO mRNA在MO/MΦ表达变化

4.2.2 PaMARCO调控香鱼MO/MΦ炎症细胞因子的表达

4.2.3 PaMARCO调控香鱼MO/MΦ吞噬和杀菌功能

4.2.4 PaMARCO调控香鱼MO/MΦ极化

4.3讨论

5结语

5.1研究成果

（1）香鱼MARCO基因克隆及其与抗菌感染的相关性

（2）香鱼MARCO蛋白的表达及其细菌结合能力分析

（3）PaMARCO对MO/MΦ功能调控分析

5.2创新点

5.3展望

参考文献

在 学 研 究 成 果

致谢