饥饿对大黄鱼5个生长相关基因甲基化的研究

摘要

大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国重要的海水养殖鱼类，在养殖越冬过程中会对大黄鱼进行饥饿处理。DNA甲基化，作为重要的表观遗传学内容之一，很容易受环境的影响。而饥饿作为一种环境因子，影响大黄鱼的代谢和生长，但是否对大黄鱼基因组DNA甲基化以及生长相关基因甲基化有影响尚未报道。本研究以养殖大黄鱼作为研究对象，利用亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）、基于酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法分别研究了不同饥饿时期大黄鱼肌肉组织和肝脏组织基因组DNA和生长相关基因（MSTN1、MSTN2、IGF1、IGF2、GH）的甲基化状态以及相应的mRNA表达量，并分析了基因组DNA甲基化与特定基因甲基化之间的关系，mRNA表达量与特定基因甲基化之间的关系。 结果表明，肌肉中，饥饿14d时基因组总DNA的甲基化水平最高，且在饥饿14d和21d时，实验组和对照组之间存在显著性差异（p＜0.05）；肝脏中，饥饿28d时因组总DNA的甲基化水平最高，在饥饿7d、14d、28d以及复投喂1w时，实验组和对照组之间存在显著性差异（p＜0.05）。在肝脏中，IGF2外显子2甲基化与总DNA甲基化之间存在显著正相关（r=0.7558）。饥饿与复投喂对肝脏基因组甲基化的影响比肌肉更为明显，且变化是波动的，这与肝脏是一种重要的代谢器官相吻合，提示饥饿有可能引起了个体生理上的不稳定性。 生长相关基因（MSTN1、MSTN2、IGF1、IGF2、GH）的CpG岛富含在外显子而不是启动子。MSTN1和IGF1的近端启动子和MSTN2的外显子1在所有饥饿阶段几乎没有甲基化。MSTN1外显子1，IGF2外显子2和GH外显子5的甲基化状态在不同饥饿时间有所不同，并且在饥饿7d时开始存在显著差异（p＜0.05）。肌肉MSTN1基因外显子1甲基化在饥饿7d、21d、28d、35d和复投喂期间各时间点存在显著性差异（p＜0.05）。肌肉GH基因外显子5区域甲基化在饥饿7d时存在显著性差异（p＜0.05）。肌肉IGF2基因外显子2区域甲基化在饥饿7d、28d、35d时间点存在显著性差异（p＜0.05）。肝脏IGF2外显子2区域甲基化在饥饿7d、28d和复投喂1w和3w各时间点存在显著性差异（P＜0.05）。饥饿对生长相关基因甲基化的影响是动态变化的，且存在基因差异性和组织差异性。这些生长相关基因（MSTN1、IGF1、IGF2、GH）的mRNA表达水平均在饥饿14d时存在显著差异（p＜0.05），但与相对应的外显子甲基化没有显著相关性，可能是因为这些区域的甲基化对基因的调控不在转录水平上，而在转录后调控上。 饥饿对大黄鱼肝脏和肌肉总基因组甲基化确实存在一定的影响，且对肝脏的影响更为剧烈，这可能与肝脏中的某些代谢通路有关。同时，饥饿对大黄鱼肝脏和肌肉生长相关基因甲基化的影响也比较明显，说明在甲基化层次上，饥饿确实对大黄鱼生长相关的代谢产生了影响。

目录

声明

引言

1绪论

1.1 DNA甲基化

1.1.1 DNA甲基化的概念与特点

1.1.2 DNA甲基化的修饰模式

1.1.3 DNA甲基化的作用机制

1.1.4 DNA甲基化的生物学功能

1.1.5 DNA甲基化的研究方法

1.1.6环境因素对DNA甲基化的影响

1.2饥饿对鱼类的影响

1.3相关生长因子研究

1.3.1 MSTN在鱼类生长中的作用

1.3.2 MSTN基因甲基化研究

1.3.3 GH在鱼类生长中的作用

1.3.4 GH基因甲基化研究

1.3.5 IGFs在鱼类生长中的作用

1.3.6 IGF1和IGF2在鱼类生长中的作用

1.4研究目的及意义

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要实验试剂和配置

2.1.3主要实验仪器

2.2实验方法

2.2.1不同饥饿时期肝脏和肌肉组织总DNA提取

2.2.2 ELISA检测总DNA甲基化

2.3结果与数据分析

2.4讨论

2.5小结

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1 CpG岛预测和BSP引物设计

3.2.2不同饥饿时期肌肉和肝脏组织总DNA提取

3.2.3亚硫酸盐处理DNA

3.2.4降落PCR扩增目的区域

3.2.5胶回收目的片段

3.2.6 TA克隆测序

3.3结果分析

3.4讨论

3.5小结

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1不同饥饿时期肝脏和肌肉组织总RNA提取

4.2.2总RNA完整性和浓度检测

4.2.3 cDNA第一链的合成

4.2.4荧光定量PCR

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5小结

5总结与展望

参考文献

在学研究成果

致谢