近年来，随着宏基因组技术的出现和广泛使用，显著拓展了人们对环境微生物多样性的认识。宏基因组技术是指不经过微生物培养，直接提取环境微生物的总基因组的技术。使用该技术，对原本在环境中超过99％的不可培养微生物基因的操作和研究成为了现实，这促使人们发现了大量具有价值的新的蛋白和活性小分子物质。 本课题研究采用宏基因组技术，针对来源于贵州铜仁梵净山的土壤微生物样本，构建了一个库容克隆数量达到5×104的宏基因组文库。基于三丁酸甘油酯水解生成透明圈的功能筛选方法，从文库中分离出新酯酶全长基因1条(命名为EstC23)。进化关系分析表明，该酶隶属于脂肪酶第Ⅳ家族(Hormone-sensitivelipase family，HSL)。对该基因的异源过表达研究表明，该基因在T7强启动子作用下，产生的可溶性蛋白占细胞总蛋白量的30％左右。纯酶蛋白的酶学性质表征显示，EstC23在25℃pH8.0条件下，对pNP-butyrat的酶活达254 U mg-1，该酶的最适反应温度为40℃，特别是在5-10℃低温下仍能维持最大活性的50％。EstC23在浓度达50％(V/V)的非极性有机溶剂（高logP）中显现出极强的稳定性，尤其在50％(V/V)的苯类和烷烃类有机溶剂中，其活力能提升至92％至274％之间，孵育一周后酶活性不会降低。同时，酯酶EstC23能水解叔醇酯底物，这是通常的酯酶或脂肪酶不具备的底物活性。这些结果表明，EstC23在酯合成、手性化合物的拆分、不稳定中间体化合物合成、肽合成等方面具有潜在应用价值。 后续我们以EstC23核酸序列为基础设计特异性引物，基于宏基因组特异性PCR技术(Metageno mic Gene Specific PCR，MGS-PCR)和截断宏基因组特异性PCR技术(Truncated Metagenomic Gene Specific PCR，TMGS-PCR)，对来自全国不同地域环境的65组宏基因组DNA进行序列筛选，分别获得了同源家族全长功能基因7条和核心片段15条，序列分析比对，这些基因及基因片段表现出了高度的序列多样性，其核酸相同百分比在50-97％之间，这些序列构成了一个新的酯酶基因亚家族。这为后续以酯酶亚家族为对象的功能研究，以及DNA-family-shuffling为方法的体外功能进化，提供了有价值的实验材料。
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