两种定向进化策略改造单胺氧化酶MAO-N-D5

摘要

手性胺在制药、农业化学及化工领域中的价值逐渐升高。它们经常被用作拆分剂，各种药学活性物质和农药的合成子。手性胺的生成包括化学和生物法两种，与化学法相比，酶法合成因其温和的操作环境等有利条件而成为环境友好型的选择。Aspergillus niger来源的单胺氧化酶经过三轮定向进化后，筛选出具有高活力、高手性选择性及广泛底物谱的突变酶MAO-N-D5。本课题在此基础上，利用两种不同定向进化策略CASTing和易错PCR，再次改造MAO-N-D5。CASTing过程中，通过分析MAO-N-D5与rac-mexilitine分子对接结果，在底物口袋附近选取6个氨基酸位点，分为三组进行定点饱和突变(A: Phe210/Leu213，B:Met242/Met246，C: Tyr365/Ile367)。第一轮单库筛选后，得到两个突变酶A-1(F210V/L213C)和A-7(F210V)，其中A-1的酶活力为100％，A-7的活力为21％，A-1的活力是A-7的4倍。第二轮，A-1与A-7同时和C突变库进行组合突变，经筛选得到另外一个有利突变酶A7C1(F210V/I367T)，活力为80％，是A-7的4倍。
　　 以CASTing最优突变A-1为起点，通过易错PCR引入随机突变，进行随机突变库的筛选，得到一个突变酶ep-1（F210V/L213C/T162A），活力为189％，在A-1的基础上提高1.9倍，底物谱研究表明，A-1与ep-1对所测的胺类底物均有催化能力，对其中4种芳香胺的催化能力比未突变的MAO-D5有显著提高。突变酶保留MAO-D5优良的手性选择性，美西律拆分反应显示，A-1的转化率为50％，ee为92％; A7C1转化率为52％，ee为95.6％; ep-1对美西律的转化率为41.8％，ees为99％。

目录

声明

致谢

摘要

1．引言

1．1 手性胺

1．1．1 化学法

1．1．2 生物法

1．2 单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)

1．2．1 单胺氧化酶种类

1．2．2 黑曲霉来源的单胺氧化酶(MAO-N)

1．3 定向进化策略

1．3．1 非理性设计

1．3．2 理性设计

1．3．3 半理性设计

1．3．4 CASTing

1．4 本课题研究内容及意义

1．4．1 研究内容

1．4．2 意义

2．半理性设计改造单胺氧化酶MAO-N

2．1 试剂与材料

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 工具酶

2．1．3 化学试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 分子对接

2．2．2 突变库构建

2．2．3 高通量平板筛选

2．2．4 96微孔板筛选

2．2．5 蛋白纯化

2．2．6 酶活力测定

2．2．7 液相分析拆分反应

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 分子对接

2．3．2 突变库构建

2．3．3 平板筛选

2．3．4 96微孔板筛选

2．3．5 蛋白纯化与SDS-PAG

2．3．6 酶活力测定

2．3．7 位点组合突变

2．3．8 高效液相色谱分析

2．3．9 小结

3．无理设计(epPCR)改造单胺氧化酶MAO-N

3．1 试剂与材料

3．1．1 菌种与质粒

3．1．2 工具酶

3．1．3 化学试剂

3．1．4 培养基

3．1．5 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 随机突变库构建

3．2．2 高通量筛选

3．3．3 酶活力测定

3．3．4 底物特异性

3．3．5 单胺氧化酶拆分反应

3．3 结果与讨论

3．3．1 随机突变库构建

3．3．2 高通量筛选

3．3．3 酶活力测定

3．4．4 底物特异性

3．3．5 高效液相分析

3．3．6 小结

4．结论与建议

4．1 结论

4．2 建议

参考文献

作者简历及硕士期间发表文章