靶向SMAD3基因的siRNA筛选及其慢病毒载体的构建

摘要

转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）和激活素A（ACTIVIN A），均为多功能的细胞因子，两者的信号途径及相关功能也是近年来的研究热点。以往的研究表明，TGF-β/ACTIVIN A与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡有关，在机体中参与了从炎症反应、组织修复到胚胎发育等一系列重要的生物学过程，并与某些人类疾病的发生密切相关。特别是在肝脏中，该信号通路的异常与肝炎、肝纤维化、肝硬化肝癌以及肝再生都有密切关系。因此对于该通路的研究具有十分重要的生物学意义，而对其各组分相互作用蛋白的研究将是阐明其功能及调控机制的关键所在。本研究旨在构建以TGF-β/ACTIVIN A下游蛋白SMAD3为靶点的短发夹RNA（shorthairpin RNA，shRNA）慢病毒表达载体，为进一步探索肝再生机制提供有力工具。目的：为研究阻断SMAD3信号传导、抑制肝细胞凋亡和促进肝细胞再生，筛选出针对大鼠SMAD3基因的siRNA片段后，构建靶向SMAD3基因的RNAi慢病毒载体质粒，产生稳定转录大鼠SMAD3 shRNA的慢病毒，并感染大鼠正常肝细胞BRL-3A。方法：根据SMAD3基因设计并合成6对siRNA，转染大鼠正常肝细胞株BRL-3A，抽取总蛋白用’western blotting方法筛选干扰效率较高的1对siRNA。根据筛选的siRNA设计并合成可表达shRNA的ssDNA，经退火制备相应dsDNA，连接入经XhoI和HpaI双酶切线性化的慢病毒载体质粒pll3.7载体，经酶切鉴定，阳性克隆测序，质粒抽提，与慢病毒包装质粒PRRE，PREV，VSVG四质粒由CaCl2导入人胚肾细胞株293FT生成慢病毒。收集包含有病毒的上清，感染靶细胞，荧光显微镜观察细胞荧光。结果：根据wb结果分析，成功筛选出一条具有较高效率靶向SMAD3基因的siRNA。经酶切、测序分析证实目的序列成功连接到载体上，载体构建成功，包装成功。成功感染BRL-3A细胞。结论：成功构建并筛选了携带有大鼠SMAD3基因的RNAi慢病毒载体及有效靶点，为进一步研究SMAD3在肝再生中的作用提供了实验平台。

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TGF-β1在肝再生中的作用研究进展（综述）

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