快速研究棉花基因功能的VIGS技术平台的初步构建

摘要

棉花是世界上最重要的经济作物之一，其生长周期比较长，适宜不同地区和国家栽培，品种差异很大。棉花植株棉酚类物质含量比较丰富，离体培养的组织或器官很容易被氧化，组织培养和离体操作比较困难，效率比较低。主要栽培的陆地棉和海岛棉是异源四倍体，基因组比较大，生长周期长，造成棉花基因功能研究的过程工作量大，且基于转基因技术进行功能分析比较困难。此前棉花基因功能研究和分子生物学研究还不是很成熟，而且棉花的EST数据库信息缺乏，极大限制了棉花分子生物学的发展；但随着野生棉雷蒙德氏棉 D基因组和栽培棉亚洲棉 A基因组测序完成，棉花数据库得到了很大的扩展。给后续的棉花分子生物学研究奠定了稳固的基础，所以快速高效进行棉花基因功能研究的方法是十分必要的。
　　在过去的植物基因功能研究中，创建突变体和转基因技术是有效的基因功能研究方法。但是对棉花来说，生长周期长和获得稳定的突变体比较困难，所以一种快速高效地进行棉花基因组功能研究方法始终是追寻的目标。VIGS（virus-induced genesilence）是一种利用修饰过的病毒作为载体，整合内源目的基因转化进入受体能引起转录后目的基因沉默的技术。在本研究中大规模转基因研究表明，VIGS是一种效率高、速度快、操作简便、可信度大、能够进行棉花从营养器官到生殖器官高效快速分析基因功能的实用技术。
　　本论文主要以修饰过的双生病毒载体pCLCrVA和pCLCrVB来研究棉花内源基因GhACNAT的生物学功能为主要研究内容。经生物信息学分析，GhACNAT属于酰基转移酶(EC2.3.1.)家族基因，该酶家族主要催化酰基的转移，参与脂质的合成与代谢。通过注射的方式将构建好的VIGS-GhACNAT系统转化进入陆地棉 C312幼苗子叶中，检测为阳性的植株进行深层次地探究，主要从GhACNAT-silence植株性状，相关基因表达分析，内源基因互作和代谢通路等方面进行分析。GhACNAT-silence植株营养器官生长无明显异常，而生殖器官出现了花粉囊不开裂、花丝变短、柱头开裂扭曲、部分花粉失活、棉铃大小形态异常等表型。GhACNAT-silence植株与阴性对照株CK（转入pCLCrV-空载）生殖器官基因表达差异经cDNA-AFLP技术分析得出，其中脂质，糖类和氨基酸的代谢过程关键酶基因表达显著改变，GhACNAT-silence植株中脂质的合成与代谢和茉莉酸合成相关的一些基因表达水平发生了显著的降低，经GC-MS测定的茉莉酸含量及其显著降低。验证试验中经外源 MeJA（茉莉酸甲酯）处理，GhACNAT-silence植株中花粉囊不开裂性状得以恢复正常开裂和花粉粒的释放。结果表明：病毒pCLCrV载体介导的VIGS系统能有效地用于棉花从幼苗到生殖器官包括种子和纤维在内的相关的基因功能探究，而GhACNAT基因是通过控制脂质和茉莉酸的合成来影响棉花的育性。

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1引言

1.1适宜棉花生长的环境条件

1.2棉纤维分类和品质鉴定

1.3棉花育种

1.4植物中一些相关功能基因的研究

1.5植物基因功能研究方法

1.6本研究的内容和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验试剂配方

2.3主要仪器

2.4感受态细胞的制备

2.5载体

2.6试剂盒

2.7研究方法

3结果分析

3.1陆地棉C312和其雄性不育突变体MS1的差异表达基因序列分析

3.2 GhACNAT基因序列的生物信息学分析

3.3 GhACNAT基因在棉花不同组织器官中的表达分析

3.4 VIGS系统的构建及幼苗注射

3.5 VIGS系统的高效性和适用性

3.6 GhACNAT基因沉默后引起的基因表达和中间产物的变化

4讨论

4.1 VIGS系统的高效性和适用性

4.2 GhACNAT基因参与调控脂肪酸合成和茉莉酸合成网络

5主要结论与展望

5.1改进的VIGS系统可以进行大规模棉花基因功能的探究

5.2绘制出GhACNAT基因调节棉花花粉囊开裂机制的简易通路图

5.3工作展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢