棉花盐胁迫诱导cDNA文库的构建与筛选及棉花金属硫蛋白基因功能分析

摘要

棉花是较耐盐碱的作物之一，在盐碱地区有大面积种植，已取得良好的经济效益和社会效益。但棉花的耐盐能力仍然有限，常规品种耐盐能力一般只有0.3％。所以，要在盐碱地广泛种植棉花，必须进一步提高棉花的耐盐能力。国内外在这方面做了大量研究，然而分子水平的研究还有待于进一步的深入下去。因此本研究分别以耐盐棉花品种中棉19号为试材，构建了棉花盐胁迫诱导cDNA文库，并通过反向northern差异筛选法获得十七个与盐胁迫相关的棉花基因克隆。并选择5号和17号克隆为研究对象，对这两个克隆的序列及同源性分析表明二者属于棉花金属硫蛋白基因家族成员。 金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量(6000～9000Da)、高Cys含量、具有金属结合能力的多肽，它具有独特的氨基酸排列顺序，即多肽的N端和C端具有两个富含Cys的金属结合结构域，其中的Cys按CXnC的方式排列。MT基因和蛋白广泛存在于动物、植物、真菌、绿藻中。植物金属硫蛋白有其独特的序列和结构特点。根据植物金属硫蛋白的结构特点，植物MT分为三类。5号克隆编码的GhMTl与17号克隆编码的GhMT2为棉花Ⅰ类金属硫蛋白。对这两个基因进行序列比较、表达分析和功能鉴定。 主要结果如下：1.利用ClontechK1053-1(634903)SmartTMcDNALibraryConstructionKit构建棉花盐胁迫诱导cDNA文库，经效价测定完全合格。 2.通过反向northern差异筛选法获得十七个在盐胁迫和正常条件下表达有差异的克隆。 3.5号克隆和17号克隆的序列同源性分析表明，二者的核苷酸序列的同源性为91.15％，氨基酸同源性为85.94％，可以断定二者为同一棉花基因家族成员。该基因家族编码蛋白与复盆子、葡萄、中华猕猴桃、番木瓜等许多植物中的Ⅰ类金属硫蛋白的同源性为70.1％，具有典型的植物Ⅰ类金属硫蛋白序列特点，聚类分析表明该棉花基因家族与复盆子、葡萄、中华猕猴桃、番木瓜等植物的Ⅰ类金属硫蛋白具有较近的亲缘关系。因此，可以断定二者属于植物Ⅰ类金属硫蛋白，命名为GhMT1、GhMT2。 4.Northern表达分析表明GhMT1受NaCl胁迫诱导表达，在一定的时间范围内其表达水平随NaCl诱导时间的延长而增加，但是在盐胁迫条件下不能被快速诱导。GhMT1也能被CuSO4、ZnSO4、低温、干旱、ABA和乙烯诱导，说明GhMT1具有金属硫蛋白受重金属诱导的功能，也说明对盐胁迫的非专一性，而是受各种非生物胁迫的诱导。同时暗示着GhMT1受ABA和乙烯信号途径的调控，可能是ABA、乙烯信号途径的靶基因。 5.Northern表达分析还表明在抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)存在的条件下，GhMT1不受NaCl、低温、干旱、百草枯(PQ，paraquat)的诱导。对过氧化氢相对水平的测定结果表明，NAC有效的抑制了NaCl、低温、干旱胁迫条件下过氧化氢水平。说明活性氧自由基是非生物胁迫诱导GhMT1及其同源家族表达的重要信号物质。 6.GhMT1和GhMT2在转基因烟草中过量表达，用GhMT1和GhMT2特异探针标记的northern杂交结果说明GhMT1和GhMT2只在转基因植株中表达。同野生型相比，转基因烟草能使转基因烟草在200，300mMNaCl条件下，4℃条件下，25％PEG条件下较好的生长。说明GhMT1及其同源家族能提高植物的抗盐能力，也能提高植物的抗其它主要非生物胁迫的能力。 7.对转基因烟草生理指标测定结果表明，在盐、4℃、25％PEG胁迫条件下转基因烟草SOD酶活性明显高于野生型烟草。说明GhMT1能够提高植物的清除活性氧自由基能力，从而提高植物抗盐、低温、干旱等非生物胁迫的能力。 8.对GhMT1体外结合Zn2+能力的测定表明，GhMT1具有金属硫蛋白家族能够结合金属离子的特性，每一分子GhMT1最多能结合5个锌离子。

目录

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摘要

1前言

2材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

5.结论

参考文献

附 录

致 谢