乙型肝炎病毒肿瘤蛋白细胞靶标HBXIP负向调控Toll样受体信号转导的机制研究

摘要

目的:
　　研究HBXIP在LPS诱导的TLR4信号转导通路中发挥的作用;阐明HBXIP在TLR4转运和降解过程中的重要作用及其机制。
　　方法:
　　1.构建pcmv-mHBXIP真核表达质粒，并测序鉴定。
　　2.定量PCR与Western blot的方法检测HBXIP的表达规律，分析LPS刺激下HBXIP的表达变化。
　　3.以小鼠巨噬细胞系Raw264.7为细胞模型，建立HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系，用定量PCR和Western blot的方法鉴定HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系。
　　4.用定量PCR和ELISA方法检测HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等炎症因子的表达情况;用Western blot的方法检测LPS诱导下NF-κB信号通路以及MAPKs信号通路的变化（包括IKKα/β、IκBα、p65、JNK、Erk、p38、IRF3等）。
　　5.通过免疫共沉淀的方法，检测HBXIP和TLR4的直接作用;通过FACS分析巨噬细胞表面TLR4的表达变化;通过Western blot的方法检测TLR4蛋白水平，用定量PCR检测TLR4的转录水平变化。
　　6.通过Western blot的方法检测HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中LC3Ⅱ的表达情况以及mTOR信号通路的变化。
　　7.采用流式细胞术分析HBXIP对巨噬细胞溶酶体数量以及溶酶体pH的影响。
　　8.利用激光共聚焦，定位分析HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中TLR4与溶酶体以及自噬小体的共定位。
　　9.Western blot方法检测HBXIP对巨噬细胞中转录因子EB(transcription factorEB，TEFB)的磷酸化水平的影响;利用激光共聚焦分析HBXIP对TFEB核转位的影响。
　　10.电镜观察HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系中溶酶体的形态。
　　11.用TFEB siRNA，Rab7 siRNA，mTORC1的激动剂Cycloheximide(CHX)，溶酶体活性抑制剂Chloroquine diphosphate(CQ)，自噬溶酶体融合抑制剂Vinblastine处理巨噬细胞，Western blot方法检测HBXIP对TLR4蛋白水平的影响。
　　结果:
　　1.HBXIP在LPS的刺激下呈现时间依赖性。
　　2.HBXIP能够使IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎因子的表达显著下调，HBXIP能减弱LPS诱导下NF-κB信号通路以及MAPKs信号通路的磷酸化。
　　3.HBXIP对TLR4的蛋白水平有靶向调控作用，HBXIP过表达能够显著抑制TLR4的蛋白表达。
　　4.HBXIP过表达能促进LC3Ⅱ的表达，抑制mTOR信号通路的相关蛋白的表达水平，促进细胞自噬。
　　5.HBXIP过表达能减少TFEB的磷酸化水平，促进其核转位，从而影响溶酶体的数量和功能。过表达HBXIP后，再用自噬溶酶体相关抑制剂处理，HBXIP对TLR4的下调作用消失。
　　结论:
　　HBXIP通过促进转录因子TFEB的活化，提高了溶酶体以及自噬溶酶体的活性，促进TLR4的内吞和降解，抑制了LPS诱导的IL-6，IL-1β，TNF-α以及IFN-β炎症因子的分泌。我们认为HBXIP是一个新的TLR4信号转导的负向调控分子。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1．绪论

2．材料和方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 mHBXIP的全长克隆

3．2 HBXIP能被LPS诱导产生

3．3 HBXIP调节巨噬细胞TLR4信号转导的研究

3．4 HBXIP抑制TLR4的表达

3．5 HBXIP对自噬的影响

3．6 HBXIP对溶酶体的影响

3．7 HBXIP促进TLR4转移到自噬溶酶体

4．讨论

参考文献

综述 Toll样受体4(TLR4)的内吞通路及其调控机制研究进展

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