3-羟基丙酸循化特征酶-丙二酸单酰辅酶A还原酶的表达、纯化与结晶

摘要

3-羟基丙酸途径是近些年发现的一种新型的CO2固定方式，首先在一种嗜热丝状不产氧光合细菌（Filamentous anoxygenic phototroph简称FAPs）中被发现。本论文的实验材料Roseiflexus castenholzii中文名称光合玫瑰弯菌，是FAPs中最新发现的一种。3-羟基丙酸循环的特征代谢中间产物是3-羟基丙酸，此化合物可用于合成许多重要的化工产品，被认为是最具开发潜力的化工产品之一。这一循环式固碳方式中涉及几种多功能酶，其中就包括催化形成3-羟基丙酸的丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)。目前已知这种酶不涉及其他的生物代谢过程，因而可以作为3-羟基丙酸循环的特征酶。对丙二酸单酰辅酶A还原酶的结构和功能的研究不仅有助于我们揭示3-羟基丙酸的形成过程，深入对3-羟基丙酸循环固碳途径的理解，同时也促进人们对多功能酶催化机制的认识。
　　本论文采用分子生物学和蛋白质化学方法对丙二酸单酰辅酶A还原酶展开了如下实验:(1)以Roseiflexus castenholzii基因组为模板，根据JGI数据库中的丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因序列设计特异性引物，PCR扩增目的片段后，将目的片段重组到表达载体pEASY-E1上，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达;(2)通过预处理、亲和层析、离子交换、凝胶过滤等方法对目的蛋白MCR进行分离纯化，纯化获得的蛋白质用抗His抗体进行Western Blot鉴定;(3)制作MCR的兔源多克隆抗体，并用兔多抗进行WesternBlot分析，进一步确认纯化的蛋白是异源表达的目的蛋白MCR;(4)用气相扩散悬滴法对纯化得到的目的蛋白进行三维晶体的结晶，成功获得MCR的三维晶体，并且进行了X-射线衍射，分辨率达到了3埃。现在对晶体的生长条件进行优化，MCR空间结构的分析将为其功能的阐明提供坚实的基础。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 引言

1．1 光合细菌概述

1．1．1 光合细菌

1．1．2 光合细菌分类

1．1．3 光合玫瑰菌

1．2 3-羟基丙酸途径的概述

1．2．1 二氧化碳固定途径

1．2．2 3-羟基丙酸途径的发现和早期研究

1．2．3 丙二酸单酰辅酶A还原酶

1．3 论文研究意义和技术路线

1．3．1 论文研究意义

1．3．2 实验设计思路

1．3．3 实验主要内容

1．3．4 技术路线

第二章 目的蛋白的基因克隆

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 培养基和实验试剂的配制

2．1．4 载体结构图

2．2 实验方法

2．2．1 光合玫瑰菌Roseiflexus．castenholzii DSM 13941的培养

2．2．2 Roseiflexus．castenholzii细菌基因组的提取

2．2．3 目的片段PCR扩增

2．2．4 PCR产物的凝胶回收

2．2．5 重组质粒pEASY-E1-mcr的构建

2．2．6 重组质粒pEASY-E1-mcr转化感受态Trans1-T1

2．2．7 菌落PCR筛选阳性重组子

2．2．8 重组质粒pEASY-E1-mcr的提取

2．2．9 重组质粒pEASY-E1-mcr转化感受态细胞BL21(DE3)

2．2．10 阳性重组子的筛选

2．3 实验结果

2．3．1 目的基因mcr的PCR扩增

2．3．2 PCR产物的切胶回收

2．3．3 重组质粒转化感受态细胞Trans1-T1及菌落PCR筛选

2．3．4 重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3)及菌落PCR筛选

2．4 小结与讨论

第三章 目的蛋白MCR的生物信息学分析

3．1 实验材料和仪器

3．2 MCR的生物信息学分析

3．2．1 蛋白质的理化性质

3．2．2 蛋白质的可溶性和琉水性分析

3．2．3 蛋白质的信号肽分析

3．2．4 叠白质的结构功能域分析

3．3 实验结果

3．3．1 蛋白质的理化性质

3．3．2 蛋白质的可溶性和疏水性分析

3．3．3 蛋白质的信号肽分析

3．3．4 蛋白质的结构功能域分析

3．4 小结与讨论

第四章 目的蛋白的表达与纯化

4．1 实验材料

4．1．1 主要实验仪器

4．1．2 主要实验试剂

4．1．3 试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 暴丙烯酰胺凝胶的配制

4．2．2 IPTG诱导目的蛋白MCR的表达

4．2．3 目的蛋白MCR表达位置的确定

4．2．4 目的蛋白MCR的纯化

4．2．5 Western blot检测目的蛋白

4．3 实验结果

4．3．1 诱导表达目的蛋白MCR表达位置的确定

4．3．2 诱导表达目的蛋白MCR的初步热处理纯化

4．3．3 诱导表达目的蛋白MCR的亲和层析

4．3．4 诱导表达目的蛋白MCR的离子交换层析

4．3．5 诱导表达目的蛋白MCR的凝胶过滤

4．3．6 Western blot检测目的蛋白

4．4 小结与讨论

第五章 多克隆抗体Western印迹分析

5．1 实验材料

5．1．1 主要实验仪器

5．1．2 主要实验试剂

5．1．2 试剂的配制

5．2 实验方法

5．2．1 纯化浓缩后目的蛋白MCR浓度的测量

5．2．2 多克隆抗体制备

5．2．3 多克隆抗体的western Blot

5．3 实验结果

5．3．1 纯化浓缩目的蛋白MCR的浓度

5．3．2 多克隆抗体的质检结果

5．3．3 多克隆抗体的western印迹

5．4 小结与讨论

第六章 目的蛋白MCR的结晶

6．1 实验材料

6．1．1 主要实验仪器

6．1．2 主要实验试剂

6．2 试验方法

6．2．1 蛋白质的浓缩

6．2．2 MCR晶体生长条件的筛选——悬滴气相扩散法

6．2．3 晶体生长条件的优化

6．3 实验结果

6．3．1 MCR晶体的电子显微镜照片

6．3．2 MCR晶体的x-射线衍射图

6．3．3 晶体生长条件的优化

6．4 小结与讨论

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

缩略语