重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子凝胶对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合的实验研究

摘要

目的:通过建立大鼠深Ⅱ度烫伤模型,观察外用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)凝胶与外用碘伏纱布包扎治疗对实验性深Ⅱ度烫伤动物的疗效比较,探讨重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子凝胶对深Ⅱ度烫伤创面的影响及促进创面愈合的作用机制。
　　方法:
　　1.模型制作:将40只SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组为20只,平均体重在(250±25)g,雌雄不限。将SD大鼠称重后以0.3％戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉,麻醉起效后于背部用6％硫化钠脱毛。24h后以0.3％戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉。所有大鼠均采用同样的烫伤条件。选用一块大小为22cm×11cm的木板,中间制作一个5cm×6cm的长方形孔,将大鼠取仰卧位四肢固定于木板上,使其背部脱毛区皮肤暴露于木板孔内,然后将木板置于热水温度为80℃的电热恒温水浴锅上,轻度按压木板使背部脱毛区皮肤浸泡在热水里,按压15s后迅速将木板离开水面即造成大鼠背部深II度烫伤,深度经组织学证实。烫伤后用干纱布揩干受伤区,在腹腔内注射5ml0.9％生理盐水进行复苏。实验组将重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子凝胶均匀涂抹于创面上,厚度约1mm,先用一层凡士林纱布覆盖,再用3-4层无菌纱布包扎,纱布外用胶布缠绕固定;对照组先将0.5％强力碘溶液用0.9％生理盐水稀释10倍配成0.5％碘溶液,然后将浸有0.5％碘溶液的纱布覆盖创面,外用3-4层无菌纱布包扎,纱布外用胶布缠绕固定。每天给药1次,连续用药13天;分别在给药后第4天、7天、10天、13天,每组随机选取5只SD大鼠处死。
　　2.创面大体观察:每天下午16时观察并记录实验组创面与对照组创面的痂壳形成与脱落情况、分泌物的情况以及创缘反应等。
　　3.创面愈合率(WHR)计算:在用药前用透明方格纸描出所有SD大鼠烫伤创面的图形并计算出该图形的面积,即为用药前的创面面积;在给药后第4天、7天、10天、13天,用透明方格纸描出每组被随机选取的5只SD大鼠处死后的创面图形并计算出该图形的面积,即为用药后的创面面积,并将用药前创面的面积减去用药后创面的面积比用药前创面的面积,即创面愈合率(wound healing rate,WHR)。
　　4.成纤维细胞(FB)计数:在给药后第4天、7天、10天、13天,实验组和对照组各随机选取5只SD大鼠处死,在创面中央进行创面取材,将烫伤创面皮肤全层完整取出后置于4％多聚甲醛液中固定。24h后,将试验所取组织进行逐级酒精脱水(75％→85％→95％→100％),用二甲苯将脱水后标本透明两次,石蜡包埋、切片,并行HE染色,在光镜下观察实验所取组织,随机法取5个视野,于400倍镜下观察,计数成纤维细胞,取其平均值。
　　5.创面微血管密度(MVD):以抗血管Ⅷ因子抗体对标本进行免疫组织化学染色,对实验组和对照组在烫伤后第4天、7天、10天、13天的实验所取组织的病理切片进行显微镜下观察并选取5个连续而不重叠的视野进行微血管计数,对比各组切片中微血管数量的差异。
　　6.创面胶原纤维的阳性面积计算:对实验组和对照组实验所取组织标本进行 Masson三色胶原染色,在光镜下观察烫伤后第4天、7天、10天、13天创面中胶原的含量,并在创面中心随机法取5个视野,与400倍镜下用Image-Pro Plus图像分析软件,测定胶原纤维的阳性面积。
　　结果:
　　1.创面大体观察:实验组创面和对照组创面经两种不同治疗方法处理后,两组的烫伤创面均随时间延长而逐渐缩小,其中实验组创面结痂速度、脱痂速度较对照组快,对照组创面分泌物相对较多,部分呈脓性分泌物;对照组创缘红、肿等创缘反应持续时间明显较实验组长。
　　2.创面愈合率:实验组和对照组烫伤创面面积均随时间延长而逐渐缩小。在大鼠烫伤后第4天的创面愈合率均呈轻度增长,实验组和对照组分别为:5.39±0.45和4.92±0.69,两者比较差异性无统计学意义(P>0.05),;在烫伤后第7天、10天、13天,实验组创面愈合率分别为:17.54±1.49、27.67±1.00、52.40±4.84;而对照组创面愈合率分别为:11.48±0.80、15.59±0.50、31.91±2.67,两者比较差异性有统计学意义(P<0.05),实验组的创面愈合率较对照组高。
　　3.成纤维细胞含量:实验组和对照组创面所取组织标本的病理切片经HE染色后,在光学显微镜下观察,烫伤后第4天,实验组和对照组实验所取组织创缘均有少许表皮细胞生长,周围有成纤维细胞及炎性细胞浸润,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在烫伤后第7天、10天,实验组创面创缘的上皮增殖情况较对照组更明显,且创面中心的成纤维细胞含量及毛细血管数目亦更多,两组创面成纤维细胞含量相比较,差异有统计学意义(P<0.05);烫伤后第13天时,实验组和对照组的成纤维细胞含量均较之前多,但实验组中创面中心的成纤维细胞含量少于对照组,两者相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　4.创面微血管密度(MVD):将实验组和对照组烫伤后第4天、7天、10天、13天创面所取组织标本的病理切片经免疫组织化学染色后,进行显微镜下观察并选取5个连续而不重叠的视野进行微血管计数,取其平均值作为该标本的微血管数值。实验组在烫伤后第4天、7天、10天、13天的微血管计数分别为:1.623±0.272、2.358±0.135、5.557±0.479、7.807±0.242;对照组在烫伤后第4天、7天、10天、13天的微血管计数分别为:0.856±0.109、1.497±0.282、3.446±0.286、6.002±0.313,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　5.创面胶原含量:将实验组和对照组烫伤后第4天、7天、10天、13天创面所取组织标本的病理切片经Masson染色后,在400倍镜下观察。烫伤后第4天,实验组和对照组创面所取组织中均有少量胶原纤维,实验组多于对照组(P<0.05);烫伤后第7天、10天、13天,实验组和对照组创面中新生胶原纤维均随时间延长逐渐增多,实验结果显示,实验组创面在烫伤后第7天、10天、13天的胶原含量始终高于对照组(P<0.05)。实验组创面中胶原纤维的排列较对照组整齐、有序,而对照组相对紊乱。
　　结论:外用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)凝胶可以促进烫伤创面痂壳形成与脱落,通过促进微血管生长、促进成纤维细胞的形成及创面胶原的形成来增加创面愈合速度及改善修复质量,与传统的外用碘伏纱布包扎换药治疗相比能明显缩短治疗过程。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

材料和方法

1 实验材料与仪器

2 试验方法

3 检测指标及方法

结果

1 创面大体观察

2 创面愈合率

3 创面成纤维细胞（FB）含量

4 创面微血管密度（MVD）

5 创面胶原含量

讨论

1 rhGM-CSF凝胶对创面愈合的实验研究的意义

2 rhGM-CSF的来源

3 rhGM-CSF凝胶在促进创面愈合中的作用

4 rhGM-CSF临床应用的展望

结 论

参考文献

致谢

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在创面修复中的应用

1 重组人粒巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的来源与结构

2 rhGM-CSF的主要生物作用

3 应用rhGM-CSF后报道过的不良反应

4 rhGM-CSF促进创面修复的展望

参考文献

声明