LPS诱导小鼠肺巨噬细胞氧化应激在自噬中的作用机制研究

摘要

目的：观察脂多糖(Lippolysaccride,LPS)对外源性过氧化氢(H2O2)刺激的小鼠肺巨噬细胞(Ana-1)的氧化损伤的影响，并通过Ana-1细胞DNA氧化损伤和自噬角度来研究LPS 诱导对Ana-1细胞氧化应激和自噬的作用机制及其相关的分子机制。方法：1.LPS刺激Ana-1细胞模型的建立及LPS诱导下Ana-1细胞氧化应激损伤模型的影响。LPS作用于Ana-1细胞，彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况，ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞内活性氧族物质(Reactive Oxygen Species,ROS)的表达情况，总SOD活性检测试剂盒(WST法)检测Ana-1细胞总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的表达情况。LPS作用于氧化应激损伤下的Ana-1细胞，通过彗星实验试剂盒检测Ana-1细胞DNA损伤的情况，ROS荧光探针-DHE检测Ana-1细胞ROS的表达情况,总SOD活性检测试剂盒(WST法)检测Ana-1细胞总SOD的表达情况。比较LPS作用于Ana-1细胞与LPS作用氧化应激状态下的Ana-1细胞的指标变化情况。2.LPS作用下的Ana-1细胞自噬现象和LPS作用于氧化应激损伤下的Ana-1细胞自噬现象。LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4小时后(LPS处理组),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化,脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3(green fluorescentprotein-microtubule associated protein light chain3,绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3)和质粒RFP-LC3(Red fluorescent protein-microtubule associated protein light chain3,红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3)观察LPS作用下的Ana-1细胞的自噬现象,免疫蛋白印记( Western Blot)法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达。LPS作用氧化应激状态下的Ana-1细胞(LPS+H2O2处理组,外源性H2O2浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后,再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h),RT-PCR法检测自噬相关因子LC3的mRNA表达水平变化,脂质体Lipofectamine2000转染质粒GFP-LC3和质粒RFP-LC3观察自噬现象, Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。维生素C抗氧化应激损伤处理后(维生素C浓度为2000ug/ml,刺激1小时后加入H2O2,浓度为12.5uM刺激Ana-1细胞2h后,再加入LPS浓度为1ug/ml刺激Ana-1细胞4h)观察LPS介导下Ana-1细胞的自噬现象以及Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。对照组用PBS刺激进行对比。比较对照组、LPS处理组和LPS+H2O2处理组以及维生素C处理组两两间所测指标的变化和差异。结果：1.LPS作用于Ana-1细胞,与对照组相比较,细胞内ROS的表达浓度增高,P<0.05具有统计学意义;总SOD的表达减少,P<0.01具有统计学意义;彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤,P<0.01具有统计学意义提示LPS处理可诱导Ana-1细胞的氧化应激损伤。LPS处理后氧化应激状态下的Ana-1细胞内的ROS的表达浓度较LPS处理组明显增高,P<0.05具有统计学意义;总SOD的表达减少,P<0.01具有统计学意义;彗星实验检测出Ana-1细胞DNA有损伤,P<0.01具有统计学意义,细胞损伤明显。2.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H2O2处理组的ROS荧光强度和荧光数量发现:LPS处理组的ROS荧光强度和荧光数量与对照组相比较有所增加,P<0.01具有统计学意义;LPS+H2O2处理组的ROS荧光强度和荧光数量较LPS处理组明显增加,P<0.01具有统计学意义。3.RT-PCR法检测自噬相关因子LC3-Ⅱ的mRNA表达水平变化示LPS+ H2O2处理组较LPS处理组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多;LPS处理组较对照组的LC3-Ⅱ的mRNA表达水平量多。4.共聚焦显微镜下观察对照组、LPS处理组、LPS+H2O2处理组和维生素C处理组的细胞自噬GFP-LC3和RFP-LC3转染情况发现LPS处理组较对照组的自噬小体有所增加;LPS+ H2O2处理组较LPS处理组的自噬小体在胞质内表达明显增加;维生素C处理组较LPS+ H2O2处理组的自噬小体有所减少。5.Western Blot法检测自噬基因BECN1蛋白表达示LPS+ H2O2处理组较LPS处理组的BECN1表达水平量增多,P<0.01具有统计学意义;LPS处理组较对照组的BECN1表达水平量增多,P<0.01具有统计学意义。Western Blot法检测自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达示维生素C处理组较LPS+H2O2处理组的LC3表达水平量减少,P<0.05具有统计学意义;LPS+H2O2处理组较LPS处理组的LC3表达水平量增多,P<0.05具有统计学意义;LPS处理组较对照组的LC3表达水平量增多,P<0.05具有统计学意义。结论：1.外源性H2O2可诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激,导致细胞损伤。LPS能加重H2O2诱导小鼠肺巨噬细胞Ana-1的氧化应激,加重细胞的DNA损伤。2.LPS能加重氧化应激下小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬。氧化应激下小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬与氧化应激细胞DNA损伤有关,LPS能加重这一现象可能是通过上调自噬相关蛋白BECN1和LC3的表达。3.通过抗氧化剂维生素C的处理发现,维生素C能减少LPS介导氧化应激的小鼠肺巨噬细胞Ana-1的自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达以及质粒GFP-LC3和质粒RFP-LC3表达,再次证明LPS通过加强氧化应激小鼠肺巨噬细胞Ana-1的细胞损伤,从而加重细胞自噬现象。

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

材料和方法

1 实验材料与仪器

2.实验方法

结 果

1 正常Ana-1细胞的形态观察

2 活性氧族物质（ROS）检测

3 氧化物歧化酶（SOD）检测

4彗星实验结果

5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测自噬相关因子 LC3 的mRNA

6 转染

7 免疫蛋白印记（ Western Blot）法半定量测定小鼠巨噬细胞中BECN1蛋白和LC3蛋白的表达

附：图表

讨 论

结 论

参考文献

英汉缩略词对照表