肝再生增强因子在 HBV相关慢加急性肝功能衰竭中的表达及其启动子区基因多态性分析

摘要

研究目的：1、了解 HBV 感染后不同程度肝功能损害患者 ALR 血清浓度变化及其临床意义。2、获得汉族人群 ALR 启动子区的 SNP 位点基因型。3、筛选出与 ACLF 有关启动子区 SNP 位点。4、检测 SNP 不同基因型间ALR 血清浓度差异。对象方法：病例收集于 2011 年至今泸州医学院感染科门诊及住院的乙肝患者,包括慢性乙肝轻度 (n=110 例)和 ACLF 组 (n=138例)以及健康对照组(n=120 名),同时运用如下方法对各组标本进行如下实验：(1)ELISA 检测：使用 ELISA 法检测各组 ALR 浓度,多组之间采用单因素方差分析,两组之间采用 t 检验。 (2)全血 DNA 提取、电泳、 PCR及测序：待检的 EDTA 抗凝全血标本,置于 37℃温箱迅速溶解,使用 QiAamp DNA Blood 试剂盒提取全基因组 DNA,并用紫外透射仪检测浓度与纯度,随之选取 DNA 标本进行 PCR 扩增,PCR 产物送 introvgen 公司测序。(4)通过 chromas 软件读序列直接判定 SNP 基因型,卡方检验比较病例组和对照组之间 SNP 基因型频率统计学差异；秩和检验分析 SNP 不同基因型与ALR 表达的关系； LD 筛选与 ACLF 有关的 ALR 启动子区 SNP 位点, 计算连锁不平衡系数 D 与 D’值. D 值代表实际情况中单体型分布频率与单体型分布频率之间的差异。 D’值则是经标准化的 D 值,范围在 0 到 1 之间； D’=0表示位点之间不存在连锁；D’=1 表示存在完全连锁；∣D’∣< l 表示存在连锁不平衡。
结果： 1 、 ALR 水平在 ACLF 组 明 显 高 于 健 康 对 照 组(2.58±1.67vs0.72±0.29,p<0.01)。 慢乙肝轻度组 ALR 水平与健康对照组相比无明显统计学差异(0.74± 0.46 vs 0.72±0.29,P=0.813),在 ACLF 血清ALR 水 平 在 生 存 组 明 显 高 于 死 亡 组 ( 7.78±1.75vs2.10±1.50 ,t=7.479,p<0.01)。多因素 logistic 分析结果表明：在校正了性别、年龄的混杂因素后, P=0.000, OR 值为 0.003, 95% (0.000,0.034)说明高浓度 ALR对于生存组患者是保护性因素,提示 ACLF 患者血清高 ALR 浓度与较好预后有相关性。2、ALR 基因启动子区 SNPs 位点在 138 名 ACLF 患者,110例慢乙肝轻度患者和 120 名健康献血员正常对照中成功进行了分型,结果显示：各 ALR 的 SNP 位点在健康对照组、慢乙肝轻度组及 ACLF 组各基因型分布无明显统计学意义(P>0.05), ALR -847A/G、 -393A/G 和-80G/A位点基因型在 ACLF 组和健康对照组中均有明显差异(P<0.05)。经多因素Logistic 回归分析校正年龄、性别等因素后：ALR-80G/A 位点与 ACLF 显著关联。-80G/A 为 ACLF 的影响因素,GA 基因型携带者为 ACLF 患病的危险因素,携带 GA 基因型的个体患病的可能性为 GG 基因型携带者的1.788 倍(P=0.028)3、ACLF 患者 SNP 各突变位点不同基因型 ALR 值经秩和检验分析,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：我们通过病例对照研究证实了 ALR 基因多态性与 ACLF 的关联,ACLF 患者 ALR 浓度与其它组相比明显升高,血清 ALR 高水平预示 ACLF 预后良好。-80G/A 位点与 ACLF 显著关联,GA 基因型与其它基因型相比,GA 基因型的个体对ACLF 易感性显著升高。ACLF 的 ALR 启动子区 SNP 不同基因型间 ALR血清浓度无明显统计学差异。

目录

封面

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 材料、仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 各组临床研究对象的基本资料

2 、HBV感染后不同程度肝功能损害患者ALR血清浓度变化

3 ALR血清浓度与ACLF预后相关性分析

4 判读ALR基因启动子区基因型

5、ALR基因启动子区SNP不同基因型的分布

6 、Hardy-Weinberg平衡定律检验

7.ACLF患者ALR基因启动子区SNP位点连锁不平衡检测

8. 阳性关联位点的多因素logistic回归分析

9、ALR基因启动子区3个SNPs位点单倍型分析

10、ACLF的启动子区不同SNP位点ALR的水平变化分析

讨论

1、ALR基因启动子区在ACLF患者的表达

2、ALR基因启动子区多态与ACLF的发生风险关系

3、ALR启动子区多态影响ACLF发生的分子机制

4、ALR启动子区不同SNP位点ALR的水平变化分析

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

肝细胞再生增强因子

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