L-Asp诱导急性髓细胞白血病细胞株HL-60凋亡

摘要

自从1967年Oetten等首次发现左旋门冬酰胺酶(L-Asparaginase, L-Asp)的抗肿瘤作用以来,它已被广泛应用于临床上许多肿瘤疾病的治疗,并且显著提高了患者的完全缓解率(CR)和长期无病生存率(DFS)。左旋门冬酰胺酶(L-Asparaginase,L-Asp)是临床上治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的主要药物,尤其对儿童患者疗效显著。以前研究者们普遍认为L-Asp抗肿瘤药理机制是:L-Asp能特异性催化门冬酰胺(Asn)分解成氨和门冬氨酸(Aspa)从而耗竭血浆中Asn。由于正常细胞内部存在充足门冬酰胺合成酶(Asparaginase synthetase,AsnS)及活性,能够催化门冬氨酸再合成门冬酰胺,从而保证了正常细胞内的蛋白生物合成不受影响。但在肿瘤细胞中,特别是急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤细胞,这些肿瘤细胞内的AsnS表达量和活性都远远低于正常细胞,所以不能为肿瘤细胞合成足够的Asn,而必须依赖细胞外Asn的供应,当细胞外Asn被L-Asp耗竭后,肿瘤细胞蛋白生物合成严重受阻,导致其DNA和RNA合成严重受抑制,最终导致细胞功能受损,肿瘤细胞死亡,此为L-Asp抗肿瘤公认的原理。但是临床治疗中发现不同类型疾病以及相同疾病的不同患者对 L-Asp敏感性和疗效都不尽相同,而且这些患者血液中的Asn都已被耗竭。这提示细胞对L-Asp的敏感性存在于细胞内部对这种氨基酸耗竭的反应性不尽相同,从而表明不能将血浆中Asn是否已被完全耗竭作为L-Asp是否发挥作用的标准。以往临床上主要是将L-Asp用于治疗ALL和NHL,一般不用于治疗髄系白血病。但是最近国内外研究表明用甲基硫氮二烯五环四唑分析法(MTT法)体外测定L-Asp对急性髄系白血病(AML)FAB分型(French-American-British subtype of acute myeloid leukemia)中M4,M5型细胞的毒性等同于对ALL细胞的毒性[2],并且此现象可用于预测临床上用L-Asp初始化疗的疗效反应。其中M5型AML对临床常规化疗药物的疗效差,预后不良,死亡率高,以上研究提示L-Asp治疗M5型AML具有独有的优势。国外还有将L-Asp联合其他化疗药物对AML患者进行化疗,或者联合异基因造血干细胞移植治疗AML患者,并取得良好疗效的报道。这些研究结果提示L-Asp具有临床治疗AML的潜在应用价值,其作用机制还没有完全阐明。L-Asp诱导AML细胞株HL-60细胞凋亡的研究国内尚无报到,要进一步了解 L-Asp的治疗潜能开展本课题研究是有必要的,以下为本课题研究内容。目的:为进一步了解L-Asp临床治疗潜能和其作用机制以及开发更有效的药物治疗AML打下实验基础。方法:众所周知,L-Asp治疗ALL的疗效是肯定的,本研究以ALL细胞株Jurkat作为阳性对照,按照MTT法原理用细胞计数 Kit-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8试剂盒)测量经L-Asp处理后两种细胞株的细胞生长抑制情况和半数抑制浓度(IC50),再做对比确定差异的统计学意义;用Annexin-V-FITC/PI试剂盒,罗丹明123(Rh23)检测磷脂酰丝氨酸外翻(phosphatidylserjine,PS)和线粒体跨膜电位(Mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)这些细胞凋亡早期的特有变化,以及用Hoechst33258荧光染料观察细胞凋亡形态,两细胞株间比较确定统计学差异。结果:L-Asp对HL-60有明显的生长抑制作用;HL-60细胞24h和48h的IC50分别为5U/ml和2.1U/ml;Jurkat细胞24h和48h的IC50分别是4.5U/ml和1.7U/ml,两细胞各时间点的IC50值比较用t检验p值均小于0.05,差异无统计学意义;经本研究凋亡指标检测证实 L-Asp能诱导 HL-60细胞凋亡。结论:L-Asp对HL-60细胞有明显的生长抑制和凋亡作用,且此作用与其对Jurkat细胞的凋亡诱导和生长抑制作用相同;L-Asp具有临床治疗AML的潜能。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

5 统计学处理

结果

1 L-Asp抑制HL-60和Jurkat细胞增殖测定结果

2 凋亡检测

讨论

1 L-Asp诱导急性髓细胞白血病（AML）细胞凋亡的意义

2 L-Asp诱导AML细胞凋亡机制的探讨

3肿瘤细胞对L-Asp的耐药性研究

结论

参考文献

L-Asp的临床应用和实验研究进展综述

1 L-Asp临床应用现状

2 L-Asp抗AML机制的实验研究

3肿瘤细胞对L-Asp的耐药性研究

4讨 论