SUMO化修饰对高糖刺激的肾系膜细胞TGF-β/Smad信号通路的调控研究

摘要

目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病特有而严重的微血管并发症,晚期以肾小球硬化和肾小管肾间质纤维化为主要病理改变。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是致纤维化的关键信号分子,而 TGF-β/Smad 通路是介导糖尿病肾病后期纤维化的重要信号通路。目前已公认TGF-β信号通路受到磷酸化、泛素化等翻译后修饰调节,近年研究显示该通路还受到小泛素相关修饰物( small ubiquitin related modifier, SUMO)化调节。SUMO及其特异性酶可通过修饰TGF-β通路中某些重要信号分子如：TGF-βI型受体( type I TGF-βreceptor,TβRⅠ)、Smad4等对该通路进行调控。既然SUMO化修饰对TGF-β信号通路有重要的调控作用,而TGF-β通路又是糖尿病肾病致纤维化的关键通路,那么SUMO化修饰是否参与了糖尿病肾病TGF-β信号通路的调控值得研究。为此,本研究观察高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞中SUMO与Smad4蛋白的表达及二者之间的相互作用,探讨 SUMO 化修饰在糖尿病肾病 TGF-β信号通路中的作用与机制。方法：高糖作为刺激因子,将体外培养大鼠肾小球系膜细胞(Glomerular Mesangial Cells,GMCs)分为5个组：正常对照组(NC组,培养基含5.6mmol/L葡萄糖)； 10 mmol/L高糖组(HG1组,培养基含10 mmol/L葡萄糖)；20 mmol/L高糖组(HG2组,培养基含20 mmol/L葡萄糖)；30 mmol/L高糖组(HG3组,培养基含30 mmol/L葡萄糖)；渗透压对照组(OP组,培养基含5.6 mmol/L葡萄糖 +24.4 mmol/L甘露醇),将各组细胞分别培养6h、12 h、24 h后用于实验。用Western-blot检测各组细胞SUMO(SUMO1、SUMO2/3、SUMO4)和Smad4蛋白表达,RT-PCR检测SUMO和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)mRNA表达；免疫共沉淀和免疫荧光双染技术分别检测肾小球系膜细胞中SUMO与 Smad4 蛋白间的相互作用及共定位关系。结果：1、与正常组比较,各高糖组SUMO1、SUMO2/3和Smad4蛋白表达均增强(P<0.05),呈一定浓度依赖性；与正常组比较,高糖作用6h后SUMO1、SUMO2/3和Smad4蛋白表达无明显变化,作用12h、24h后表达逐渐增加(P<0.05)；SUMO1和Smad4表达在渗透压组与正常组间差异无统计学意义(P>0.05),SUMO2/3 渗透压组较正常组表达有所增加,但明显低于 20mmol/L 和 30mmol/L 葡萄糖组(P<0.05)；SUMO4在大鼠肾系膜细胞中不表达；2、免疫共沉淀结果显示肾小球系膜细胞SUMO2/3与Smad4在各组均存在相互作用,并在高糖刺激后显著增强(P<0.05),而SUMO1与Smad4间无相互结合作用；3、免疫荧光双染结果表明SUMO2/3与smad4在肾小球系膜细胞内存在共定位现象,且在高糖组更明显；4、与正常组比较,各高糖组SUMO1、SUMO2/3和FN mRNA表达均增强(P<0.05),呈一定浓度依赖性；与正常组比较,高糖作用12h、24h后SUMO1、SUMO2/3和FN mRNA表达均明显增加(P<0.05)。 结论： 1.高糖可诱导肾系膜细胞SUMO和FN表达增强,提示 SUMO 在糖尿病肾病纤维化发病中可能有重要作用； 2.SUMO2/3共价修饰Smad4参与糖尿病肾病时TGF-β信号通路的激活。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 高糖作用的肾系膜细胞 SUMO蛋白表达

2 高糖作用的肾系膜细胞Smad4蛋白表达

3 高糖作用的肾系膜细胞SUMO与Smad4蛋白的相互作用

4 肾系膜细胞SUMO2/3与Smad4的荧光双染共定位

5 高糖作用的肾系膜细胞 SUMO 、纤维连接蛋白（FN）的mRNA表达

讨论

1 高糖对肾系膜细胞SUMO蛋白表达的影响

2 高糖对肾系膜细胞Smad4和FN表达的影响

3 SUMO对高糖刺激的肾系膜细胞TGF-β通路的调控作用

结论

参考文献

英汉缩略词对照

致谢

SUMO化修饰对TGF-β信号通路的调控作用