甘露糖化壳聚糖纳米粒与肿瘤组织结合能力的研究

摘要

目的:采用免疫组化染色的方法观察肝癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌病理标本中肿瘤及正常组织中的肿瘤相关巨噬细胞、M2巨噬细胞、M1巨噬细胞相关受体表达情况，进而了解以上细胞的数量;寻找一种相对简便、经济、稳定的甘露糖化壳聚糖粒制备流程和方法;利用TAMS、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞细胞表达丰富的甘露糖受体，以及甘露糖化壳聚糖纳米粒能与甘露糖受体特异性结合的原理，在肝、乳腺、胃、大肠的组织切片中观察和评价甘露糖化壳聚糖粒与肿瘤组织的结合能力，从而探求一种肿瘤的靶向治疗新靶点与新方法。
　　方法:收集结肠癌、乳腺癌、胃癌及肝癌各50例患者的组织切片，每例患者组织切片均包含有肿瘤及正常组织，肿瘤组织组为观察组，正常组织组为对照组，通过运用免疫组化的方法对肿瘤相关巨噬细胞的特异性标记物CD68、CD163进行染色，在光镜镜视野下对表达为黄褐-深褐色的阳性染色细胞进行计数，评价TAMs、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞在各类肿瘤组织、正常组织中所占的比例;采用离子交联法构建出不同粒径大小甘露糖化壳聚糖纳米粒，取19mg壳聚糖并配置成为浓度4mg/ml的溶液，在其中加入1％的冰醋酸，在室温下搅拌4h，至溶液清澈。配置0.5mol/L氢氧化钠溶液，将壳聚糖溶液的PH值调至6.23，加入5mg甘露糖于壳聚糖溶液中;反应结束后继续使用0.5mol/L氢氧化钠溶液滴加入合成溶液中，有大量沉淀析出，转移至试管中，3000rpm/min离心，去掉上清后，依次使用蒸馏水，甲醇，乙醇洗涤2次，最后得到固体沉淀。使用蒸馏水将得到的固体沉淀完全溶解后，放入透析袋（截留分子量800），清水透析24小时，再将所剩的溶液倒出培养皿中，进行冷冻干燥2天。所获得产物即为成功枝节甘露糖的壳聚糖。取100mg制作好的甘露糖化壳聚糖干粉，将其溶解在蒸馏水中，配置成为浓度1mg/ml的溶液，并使用0.5mol/L的氢氧化钠溶液将该溶液的PH调至7.48;在30℃水浴条件下配置浓度为4mg/ml的ZOL溶液，ZOL按质量比1∶3加入甘露糖化壳聚糖溶液中，室温下搅拌30分钟，将得到的合成产物分别放入透析袋（截留分子量800）中，清水透析24h，透析后所得的溶液进行冷冻干燥2天。所得产物即为甘露糖化壳聚糖纳米颗粒。利用荧光染料FITC结构中的异硫氰基与甘露糖化壳聚糖纳米粒中的伯胺基反应，生成对应的取代硫脲，并用荧光扫描检测其荧光继发波长及最大吸收波长。在激光粒度分析仪下测量粒径大小;利用纳米粒携带的甘露糖与肿瘤组织里面TAMs细胞表达的甘露糖受体可以特异性结合的原理，将肿瘤石蜡组织切片经过脱蜡、抗原修复以后，加入适当比例的不同粒径甘露糖化壳聚糖纳米粒PBS悬浊液，37℃孵育过夜，弃溶液，PBS溶液冲洗，冷冻干燥。在荧光显微镜下观察肿瘤组织及正常组织与纳米粒的结合情况，观察荧光染色细胞的分布以确定其结合位置，通过阳性染色细胞计数可反映出两者结合能力的大小。最后对免疫组化结果做t检验统计分析数据，其中将CD68+巨噬细胞数量视为TAMs数量，CD163+巨噬细胞数量视作M2巨噬细胞数量，M1巨噬细胞数量由TAMs与M2巨噬细胞数量的差值计算得出;对免疫荧光染色结果做Fisher精确检验统计分析数据。
　　结果:以每高倍镜下阳性染色细胞数量判断免疫组化表达阳性强度，观察到以CD68为阳性标记的TAMs大量表达于人乳腺癌、胃癌、结直肠癌癌巢、癌周组织中的细胞膜上，在乳腺、胃、大肠的正常对照组织中仅有少量表达，其差异具有统计学意义;而肝癌组织切片TAMs表达数量显著少于正常肝组织，差异具有统计学意义。以CD163为阳性标记的M2巨噬细胞在受体于乳腺癌、胃癌、结直肠癌的癌周细胞膜、胞浆中有大量表达，在正常组织中极少表达，差异有统计学意义;肝癌组织切片中M2巨噬细胞表达数量略多于正常肝组织，但差异不具有统计学意义。计算得出的肝、乳腺、胃、大肠肿瘤组织M1巨噬细胞数量均显著多于正常组织，差异具有统计学意义。采用离子交联法成功制备出粒径在0.05um-1um的甘露糖化壳聚糖纳米粒，其理化性质稳定。甘露糖化壳聚糖纳米粒对组织病理切片及正常切片进行结合处理后观察，癌巢、肿瘤周围5HP/每片，并对免疫荧光染色的细胞进行计数，发现各肿瘤组织观察组和正常组织对照组在纳米粒免疫荧光染色阳性细胞数量差异显著，肿瘤组织免疫荧光染色程度均高于正常组织，差异具有统计学意义。
　　结论:M1巨噬细胞、M2巨噬细胞广泛表达于肝癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌的癌组织中。其中M1巨噬细胞、M2巨噬细胞在乳腺、胃、大肠肿瘤组织切片中的表达数量显著多于正常组织;M1巨噬细胞在肝肿瘤组织中的表达数量显著多于正常肝组织，M2巨噬细胞在肝肿瘤组织表达数量与正常肝组织无明显差异。M2型巨噬细胞在肿瘤组织与正常组织中表达数量的差异性要明显强于M1型巨噬细胞;粒径为0.05um-1um的甘露糖化壳聚糖纳米粒具有与肝、乳腺、胃、大肠肿瘤组织特异性结合能力，而与肿瘤旁正常组织中少有结合，差异具有显著性，提示甘露糖化壳聚糖纳米粒具有一定的肿瘤靶向性，这将为肿瘤治疗中有关治疗靶点选择、靶向药物研制提供了一种新思路。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 CD68免疫组化染色观察结果

2 CD163免疫组化观察结果

3 M1型巨噬细胞数量估算

4 M1与M2巨噬细胞在肿瘤及正常组织切片中的表达差异性

5 甘露糖化壳聚糖纳米粒制备结果

6 肿瘤及正常组织与甘露糖化壳聚糖纳米粒的结合情况

讨论

1 甘露糖化甘露糖化壳聚糖纳米粒与肿瘤组织结合能力的研究

2 TAMS、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞在胃、乳腺、大肠肿瘤组织及正常组织中的表达特点

3 甘露糖化壳聚糖纳米粒制备与其靶向性评价

4 存在的问题及展望

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

综述 肝癌微环境中巨噬细胞的表达及意义及其靶向治疗研究进展

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