超声造影剂介导下增强腺病毒相关病毒心肌靶向转染率的实验研究

摘要

目的：本研究旨在探讨超声造影剂介导下增强标记有GFP报告基因的腺相关病毒载体（rAAV2-GFP）心肌内靶向转染的转染效率。本研究探讨经系统输入法，超声介导下rAAV2-GFP心肌转染的重组腺相关病毒的最佳滴度；探讨超声造影剂介导下增强rAAV2-GFP心肌靶向转染前后心功能的变化；探讨超声造影剂介导下rAAV2-GFP在心肌内的靶向转染效率。
　　 方法：将同种属同窝别同年龄雌雄不限SD大鼠，体重为250～350克，随机分为7组，每组3只，共21只。包括6个实验组和1个对照组。根据rAAV2-GFP滴度不同将实验组分为以下6组：1组滴度为1.5×109vg/ml；2组滴度为3.0×109vg/ml；3组滴度为1.5×1010vg/ml；4组滴度为3.0×1010vg/ml；5组滴度为1.5×1011vg/ml；6组滴度为3.0×1011vg/ml。苯巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉。各实验组通过尾静脉注入携带上述不同滴度rAAV2-GFP的SonoVue微泡造影剂1.2ml。对照组通过尾静脉注入1.2ml的SonoVue。首先使用GE Vivid 7 Dimension超声诊断仪所配备的i13L线阵探头，探头频率为10～14MHz，经左胸壁进行心脏超声心动图检查。仪器设置为低机械指数MI﹦0.4（mechanical index，MI）。当心肌组织内见微泡造影剂充盈时立即换成M3S探头，探头频率为2.0～3.5MHz，启用二次谐波功能，发射频率为1.3MHz，接收频率为2.6MHz并进入反向编码实时心肌造影模式，使机械指数调至1.02，利用FLASH（fast low-angle shot，FLASH）功能破坏心腔及心肌组织中的造影剂微泡，并进行心电触发，每三到六个心动周期触发一次，以达到定点爆破造影剂微泡的目的。每触发一次间隔2～5秒，以利于下一心动周期有足够的超声造影剂进入心肌组织内。14天后，麻药过量处死大鼠。取心脏组织做冰冻切片，切片厚度为5μm以下。荧光显微镜下观察心肌内荧光的表达量代表腺相关病毒载体的转染量；将同种属同窝别同年龄雌雄不限SD大鼠，体重250～350克，随机分为2组，每组10只，共20只。采用苯巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉。对照组给予单纯尾静脉注射超声造影剂SonoVue并于体表心脏部位进行超声照射破坏造影剂微泡（不携带rAAV2-GFP）；实验组给予尾静脉注射携带有rAAV2-GFP的微泡造影剂SonoVue并于体表心脏部位进行超声照射。使用i13L线阵变频探头，探头频率为10～14MHz，仪器设置为低机械指数MI=0.4，行超声心动图实时监测，当超声微泡进入心肌组织内时，立即换成M3S探头，参数设置同前，爆破微泡至微泡完全消失，从而达到定点爆破造影剂微泡、定点释放rAAV2-GFP、促进腺相关病毒载体定点转染至心肌组织内的目的。分别于实验前及实验后14天由同一名有经验的超声心动图医师完成心功能数据的采集。分别采集大鼠二尖瓣水平短轴、乳头肌水平短轴及心尖短轴二维灰阶动态图（帧频为92～123frames/s）各3个心动周期，保持心率一致，储存于EchoPAC工作站。使用EchoPAC工作站做后处理分析。应用2DS分析软件，对每一动态图像分别于收缩末期手动勾画左室心内膜边界，软件自动生成感兴趣区（ROI），调整ROI宽度使其包纳心肌全层。运行程序后软件自动逐帧追踪ROI内心肌运动，并将室壁划分为6个节段，得出各节段及左室整体的应变、应变率、旋转角度、扭转角度、达峰时间等参数：乳头肌水平短轴切面测量左室周向应变（SC）、收缩期周向应变率（SrcSYS）、舒张早期周向应变率（SrcE）舒张晚期周向应变率（SrcA）。二尖瓣水平短轴及心尖水平短轴测量心底整体最大收缩期旋转角度（RotMV）、心尖整体最大收缩期旋转角度（RotAP）。逆时针方向旋转角度定义为正值，顺时针方向旋转角度定义为负值。左室扭转角度（Lvtor）定义为：Lvtor=RotMV－RotAP。对不同大鼠间心率差异进行时间校标，将主动脉瓣关闭时间点（AVC）设定为收缩期末，下一个心动周期的R波顶点设定为舒张期末，测量扭转峰值角度、达峰时间。采用二维及M型超声心动图分别记录心率（HR）、左室舒张末期容积（EDV）、左室收缩末期容积（ESV）、左室射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）；将同种属同窝别同年龄体重相近雌雄不限的SD大鼠随机分为6组，每组10只，共60只，体质量为250～350克。给予苯巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉。分别采用以下方法给予干预：第一组给予单纯经尾静脉注射超声造影剂SonoVue并同时进行体表心脏部位超声照射爆破微泡造影剂（不携带rAAV2-GFP）；第二组给予单纯经鼠尾静脉注射rAAV2-GFP，但不进行超声照射；第三组给予尾静脉注射rAAV2-GFP并进行体表心脏部位超声照射爆破微泡造影剂；第四组先给予尾静脉注射超声造影剂后进行体表心脏部位超声照射爆破造影剂微泡，再给予尾静脉注射rAAV2-GFP；第五组只给予尾静脉注射携带rAAV2-GFP超声造影剂但不进行超声照射；第六组给予造影剂携带rAAV2-GFP尾静脉注射，当心肌内见微泡造影剂充盈时于体表心脏部位进行超声照射，爆破微泡造影剂。进行超声照射的所有实验组，首先用i13L线阵探头，探头频率为10～14MHz，仪器设置为低机械指数MI=0.4进行超声心动图实时观察。当心肌组织内可见造影剂微泡充盈时立即更换探头为M3S，参数设定同前，爆破心脏内的微泡造影剂，至心肌内微泡完全消失。14天后麻药过量处死动物，取心脏、肝脏、脑组织做冰冻切片荧光显微镜下进行荧光表达情况的观察。结果：各实验组中均见不同程度的荧光表达，而对照组中心肌内未见荧光表达。实验组中注入rAAV2-GFP的滴度为1.5×109vg/ml和3.0×109vg/ml组心肌内荧光表达量极少；注入rAAV2-GFP滴度为1.5×1010vg/ml和3.0×1010vg/ml组心肌内有荧光表达，但表达量亦较少；注入滴度为1.5×1011vg/ml组荧光的表达量较低滴度组有了大幅度的增加，近12倍，差异有统计学意义（P＜0.01），且荧光亮度清晰可见，完全可以满足研究中对rAAV2-GFP转染情况的观察。虽然随着注入滴度增加心肌内荧光表达量亦有增加，注入rAAV2-GFP滴度为3.0×1011vg/ml组心肌内荧光的表达量更多，然而只比注入1.5×1011vg/ml滴度组增加了一倍，且增加了经济成本。因而认为经尾静脉注入1.5×1011vg/ml的rAAV2-GFP为超声介导下增强rAAV2-GFP心肌转染的最佳滴度；对照组与实验组大鼠的心率、左室舒张末期容积、左室收缩末期容积、左室射血分数、短轴缩短率、左室周向应变、收缩期周向应变率、舒张早期周向应变率、舒张晚期周向应变率、左室扭转角度，各项心功能指标处理前后比较均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。并且处理后对照组与实验组心功能的上述指标亦均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；给予尾静脉注射携带rAAV2-GFP的超声微泡造影剂并进行体表心脏部位超声爆破微泡造影剂组，心肌内荧光的表达量较其它组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。先给予尾静脉注射造影剂微泡再给予体外心脏部位超声照射，而后再给予rAAV2-GFP尾静脉注射组，心肌内荧光表达较单纯尾静脉注射rAAV2而不给予超声照射组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。尾静脉注射rAAV2-GFP并同时进行超声照射组心肌内荧光的表达量较给予造影剂携带rAAV2-GFP注射而不给予超声照射组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。只给予rAAV2-GFP不行超声照射组与给予携带rAAV2-GFP的微泡造影剂注射而不予超声照射组相比心肌内荧光表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。单纯给予尾静脉注射超声造影剂并超声爆破造影剂微泡组心肌内未见荧光表达。除只给予尾静脉注射超声造影剂并进行超声照射组，肝脏内未见荧光表达外，其他各组肝脏内均见荧光表达。但肝脏内荧光表达量各组间相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。而给予尾静脉注入携带rAAV2-GFP超声造影剂并进行超声照射组心肌内荧光表达量较肝脏中增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。其它各组中心肌内荧光的表达与肝脏中荧光的表达差异无统计学意义。脑组织冰冻切片内未见荧光表达。
　　 结论：超声及超声造影剂介导下同时在体表心脏部位进行定点爆破可以高效安全地促进腺相关病毒载体在心肌内的靶向转染。经尾静脉输入法超声介导下增强腺病毒相关病毒心肌靶向转染的腺病毒相关病毒的最佳滴度为1.5×1011vg/ml；超声介导下增强腺病毒相关病毒心肌靶向转染对大鼠左心功能无影响。该方法安全可靠；超声介导下微泡破裂法可以实现腺病毒相关病毒心肌靶向转染且可提高其在心肌内的转染效率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一部分:超声介导下重组腺相关病毒载体转染心肌的最佳滴度的实验研究

第二部分:超声介导rAAV2-GFP心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能变化的实验研究

第三部分:超声造影剂介导下腺病毒相关病毒心肌靶向转染率的比较

全文总结

致 谢

参考文献

综述:超声及微泡造影剂与基因转染

个 人 简 历

攻读博士学位期间发表的学术论文