rAAV9介导抗NF-kB核酶基因体外转染心肌细胞及对NF-kB活性影响的研究

摘要

目的：研究9型重组腺相关病毒介导抗NF-kB核酶基因（rAAV9-EGFP-R65）对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对核转录因子-kB（NF-kB）活性的影响。方法：含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的9型重组腺相关病毒（rAAV9）按转染复数（MOI）1×105、1×106、1×107v.g./cell转染H9C2细胞，转染后在倒置荧光显微镜下观察H9C2细胞中EGFp阳性表达情况，采用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染效率。观察转染后细胞生长形态，并用Alamar Blue法检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖影响。同样方法处理rAAV9-EGFP-R65（MOI=1×106v.g./cell）。以肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、rAAV9-EGFP-R65及二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）处理H9C2细胞，凝胶迁移滞后实验（EMSA）检测NF-kB活性。结果：rAAV9-EGFP转染后第1天，MOI=1×106、1×107组中EGFP开始表达，第2天，MOI=1×105组开始表达，各组EGFP表达强度随MOI值的增高而增强，同时EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第4天达到高峰，此时流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染率分别为MOI=1×105组：（14.1±0.2）%、MOI=1×106组：（35.1±4.8）%、MOI=1×107组：（56.8±0.1）%。rAAV9-EGFP-R65（MOI=1×106）转染后第1天，EGFP开始表达，EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第5天达到高峰，此时流式细胞仪检测转染率（32.27±3.19）%。rAAV9-EGFP及 rAAV9-EGFP-R65转染H9C2细胞后，细胞生长及形态正常，Alamar Blue法进一步检测表明转染组对H9C2细胞增殖无影响。常态下H9C2细胞NF-kB有一定活性，TNF-a刺激后NF-kB活性明显增高，且TNF-a对H9C2细胞生长有抑制作用，而rAAV9-EGFP-R65、PDTC抑制NF-kB活性。结论：rAAV9-EGFp及rAAV9-EGFP-R65能够有效地转染H9C2细胞，且对H9C2细胞增殖无明显抑制。TNF-a可激活H9C2细胞中NF-kB信号通路，提示TNF-a对H9C2细胞的调节作用部分是通过激活NF-kB信号通路实现的。rAAV9-EGFP-R65能显著抑制H9C2细胞NF-kB活性，为进一步研究奠定了基础。

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综述 核转录因子-κB与冠心病的研究进展

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