真菌松茸提取物在HBV转基因小鼠癌变中化学预防作用的初步评价

摘要

目的：在建立稳定的HBV转基因小鼠模型的基础上，应用真菌植物松茸提取物、α-干扰素化学性预防治疗HBV转基因小鼠，初步评价真菌植物松茸提取物与α-干扰素预防HBV转基因小鼠肝脏癌变作用的效果，研究真菌植物松茸提取物等药物可能的对HBV转基因小鼠组织、生化、免疫等方面的影响，进一步说明上述药物抑制HBV转基因小鼠肝脏癌变的作用机制。
　　 方法：按照标准随机选择56只HBV转基因小鼠C57BL／6J-TgN，随机分为真菌松茸提取物（AMH）组、α-干扰素（INF-α）组、α-干扰素联合AMH组、阴性对照组。每组14只，根据不同的给药方式预防性治疗12个月，其中，第11月经眼球内眦静脉取血1次，测血清AST。第12月末，每只小鼠称取体重，经摘眼球取血处死动物，待测血清标本。采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA法）测定血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-10（IL-10）；切除小鼠肝脏，称取肝脏的重量，观察肝脏的形态及有无异常结节性改变，并观察肺、脾、肾和淋巴结有无肿瘤及转移灶，一部分肝脏组织保存于10%福尔马林溶液中，另一部分肝脏组织立即放入冻存管中保存于液态氮中存储。制作标本蜡块和病理切片，光镜下观察不同组肝组织结构变化，包括非癌变组织和癌变组织的变化。确定每组小鼠中发生肝组织癌变的具体数量，计算不同组中转基因小鼠肝组织癌变的百分数。肝组织做成切片进行免疫组化检查，显微镜下观察乙肝表面抗原（HBsAg）、转化生长因子β1（TGF-β1）、转化生长因子β1受体II（TβRII）、磷酸化Smad2/3（P-Smad2/3）、Smad4、Smad7在肝脏组织中的表达。以出现棕黄色为阳性，进行结果分析。选取液态氮中存储的肝脏组织，行实时荧光定量PCR检测（Real-time fluorescent quantitative PCR，RT-PCR）。
　　 结果：1）肝脏组织形态改变：大体形态肝脏增大、肿胀，肝脏肿瘤结节为灰白色的单个或多个结节。光镜下可见：肝细胞弥漫性肿胀，细胞胞质伊红均染（毛玻璃样变），核内可见嗜酸性小体，肝细胞坏死，伴淋巴细胞浸润，散在单个肝细胞质固缩深染伴核固缩深染。肿瘤内可见明显异常核分裂像，癌细胞向肝组织周围浸润。AMH组预防性用药后，上述表现程度上稍轻，癌变发生的百分数稍低，但不能完全防止全部转基因小鼠肝脏炎性改变及癌变的发生；2）血清学指标：经治疗干预后，AMH组（294±51）、α-干扰素组（231±59）和α-干扰素联合AMH组（215±64）的AST值均低于阴性对照组（322±45）（P＜0.05）。Α-干扰素组、α-干扰素联合AMH组AST值分别低于AMH组（P＜0.05）。而α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组比较，AST值差别无统计学意义（P＞0.05）；α-干扰素加AMH组（58.43±14.42）、AMH组（25.37±8.36）、α-干扰素组（35.84±12.36）与阴性对照组（15.75±8.45）相比，血清IL-2有增高（P＜0.05）；α-干扰素加AMH组与AMH组和α-干扰素组相比IL-2升高（P＜0.05）；α-干扰素加AMH组（12.03±6.54）与阴性对照组（45.97±14.03）、AMH组（21.58±11.20）、α-干扰素组（18.74±9.36）相比，血清TNF-α有明显降低（P＜0.01）；α-干扰素加AMH组（160.25±70.03）、AMH组（289.58±110.20）、α-干扰素组（240.69±95.36）与阴性对照组相比（375.03±120.48），血清IL-10值降低（P＜0.05）；α-干扰素加AMH组与AMH组、α-干扰素组相比，血清IL-10值也有降低（P＜0.05）；α-干扰素加AMH组中血清AST的水平与血清TNF-α水平呈负相关（F值6.529，P＜0.05）；3）免疫组化与RT-PCR指标：经治疗干预后，AMH组（4.92±1.20）、α-干扰素组（4.57±1.09）和α-干扰素联合AMH组（2.86±0.94）肝组织中的TGF-β1的表达均低于阴性对照组（6.53±1.78）（P＜0.05）。联合AMH组分别与AMH组、α-干扰素组比较，肝组织中TGF-β表达的变化均有统计学意义（P＜0.05）；经治疗后，AMH组（3.51±1.78）、α-干扰素组（4.63±1.44）和α-干扰素联合AMH组（5.72±1.55）肝组织中Smad4的表达均高于阴性对照组（3.06±0.87）（P＜0.05）。Α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad4的表达高于AMH组有统计学意义（P＜0.05）；经治疗干预后，AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中P-Smad2/3的表达均高于阴性对照组（P＜0.05）。Α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad4的表达分别高于AMH组、α-干扰素组有统计学意义（P＜0.05）；经治疗干预后，AMH组（4.10±0.75）、α-干扰素组（4.57±0.93）和α-干扰素联合AMH组（5.38±1.25）肝组织中TβRⅡ的表达均明显高于阴性对照组（3.36±0.62）（P＜0.01）；经治疗后，AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中P-Smad2/3的表达均低于阴性对照组（P＜0.05）。阴性对照组（5.38±2.21）、AMH组（5.19±1.91）、α-干扰素组（4.86±1.82）肝组织中Smad7的表达均高于α-干扰素联合AMH组（2.17±1.64）（P＜0.05）。Α-干扰素联合AMH组肝组织中TGF-β1mRNA的表达低于阴性对照组（P＜0.05）。Α-干扰素联合AMH组肝组织中TβRⅡmRNA的表达高于阴性对照组（P＜0.05）。AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad2mRNA的表达均高于阴性对照组（P＜0.05）。
　　 结论：1）HBV转基因C57BL／6J-TgN小鼠可以从HBV慢性感染状态发展到肝癌形成的过程，可以部分模拟人类的该病转归；2）应用HBV转基因C57BL／6J-TgN小鼠观察不同药物化学预防性治疗后，AMH可以明显改善肝脏功能，降低血清转氨酶水平，减缓癌变的发生；3）AMH可以诱导HBV转基因小鼠Th1类细胞因子作用增强，Th2类细胞因子作用降低，抑制恶性肿瘤的生成；4）AMH可能通过影响TGF-β/Smad信号通路的传导，降低肝癌的发生；5）AMH和α-干扰素的联用在预防肝癌发生中效果可能更强。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一部分:乙肝转基因小鼠模型的长期观察和形态功能的改变

第二部分:真菌植物松茸提取物预防乙肝转基因小鼠癌变的免疫状态的研究

第三部分:真菌植物松茸提取物对乙肝转基因小鼠肝组织中TGF-β/Smad信号通道表达的影响

总 结

致 谢

参考文献

综述:乙肝病毒转基因小鼠模型的研究进展与应用

个人简历

攻读博士学位期间发表的学术论文