细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建和血清学诊断价值的比较

摘要

目的：构建pET32a-EgAgB8/1原核表达载体和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达载体，并诱导表达和纯化细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原，比较两个重组蛋白对囊型包虫病（CE）的血清学诊断价值。
　　 方法：从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA，反转录生成cDNA，以此cDNA为模板，用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段，经测序后，以此两条基因片段为依据，扩增EgAgB8/1抗原编码核酸序列和人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列，分别克隆至pMD18-T载体，测序鉴定其正确性。通过对pMD18-T/EgAgB8/1重组质粒和pMD18-T/EgAgB8/1-EgAgB8/2重组质粒分别进行双酶切，将获得的EgAgB8/1抗原编码核酸序列和EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列，用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上，测序鉴定插入片段正确性后，转化至E.coli BL21（DE3)LysS， IPTG诱导pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达质粒，表达和纯化EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白，用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白，并通过超声裂解法进行纯化，Western blot法分别检测两个重组蛋白与中间宿主CE病人的血清学反应情况。
　　 结果：测序表明，EgAgB8/1抗原编码核酸序列和EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列均正方向插入至pET32a(+)质粒。SDS-PAGE电泳分析显示，细粒棘球绦虫pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达质粒得到成功的诱导表达，分别在蛋白分子量约28kDa和38kDa处有表达条带，通过超声裂解法获得了纯化的重组蛋白。Western blot结果表明，EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白均能被CE病人血清特异性的识别。16例CE病人血清中，EgAgB8/1重组蛋白11例呈阳性反应， EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白13例呈阳性反应。同时，用EgAgB8/1和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白检测12例囊虫病人的血清，EgAgB8/1重组蛋白出现5例阳性反应， EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白出现3例阳性反应。
　　 结论：成功构建了pET32a-EgAgB8/1原核表达质粒和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达质粒，诱导表达和纯化出EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白，Western blot结果表明， EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白对囊型包虫病的血清学诊断价值优于EgAgB8/1重组蛋白。

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