9型腺相关病毒介导R65核酶基因转染人脐静脉内皮细胞对NF-κB信号通路干预的研究

摘要

目的：以9型腺相关病毒（Recombinant Adeno-associated Virus Serotyoe9, rAAV9）为载体介导R65核酶基因重组成rAAV9-eGFP-R65转染人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），观察是否能抑制氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）诱导的HUVECs细胞NF-κB通路的激活，进而减轻细胞炎症反应和细胞凋亡。
　　方法：传代培养HUVECs，用rAAV9转染HUVECs细胞，流式细胞仪测定细胞的转染效率，选择最佳转染效率进行转染，并检测 rAAV9的HUVECs和人主动脉平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cells，HASMCs）的转染效率区别。氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）诱导HUVECs细胞激活NF-κB通路，rAAV9-eGFP-R65转染HUVECs抑制ox-LDL诱导的NF-κB激活，Western blot检测各组细胞P65和P50蛋白的表达，免疫荧光定位检测 NF-κB通路 P65和P50的转位激活，ELISA检测NF-κB通路下游相关蛋白表达。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
　　结果：（1）流式结果显示当 MOI为1×107 v.g./cel1时rAAV9-eGFP-R65在HUVECs和HASMCs的转染效率分别为(52.8±2.05)％和(52.40±3.21)％。倒置荧光显微镜及流式细胞仪结果均显示rAAV9-eGFP-R65可高效稳定转染HUVECs和HASMCs，eGFP的表达高峰分别在第6天和第5天。（2）Western blot结果显示：ox-LDL或高脂血清均可诱导HUVECs激活NF-κB信号通路，导致P65和P50核蛋白表达增高，并且ox-LDL诱导存在浓度和时间剂量关系。（3）Western blot结果显示 rAAV9-eGFP-R65转染HUVECs可显著抑制NF-κB通路P65和P50核蛋白表达。免疫荧光定位检测发现，rAAV9-eGFP-R65转染组可明显减轻ox-LDL诱导的P65核转位。（4）ELISA结果显示，rAAV9-eGFP-R65转导可有效减轻ox-LDL诱导的HUVECs细胞炎性损伤和细胞内皮功能损伤。（5）流式细胞仪结果显示，rAAV9-eGFP-R65转导可有效减轻ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡。
　　结论：rAAV9-eGFP-R65载体可高效、稳定地转染HUVECs，表达高峰在第6天。rAAV9介导R65核酶基因转染可减轻HUVECs细胞NF-κB通路的激活，并可有效减轻ox-LDL诱导的细胞炎性损伤和细胞凋亡。

目录

封面

声明

中英文缩略词对照表

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 材料

1.1主要材料与仪器

1.2 主要试剂及材料

1.3 主要试剂配制

2 方法

2.1 重组腺相关病毒体外转染效率的测定

2.2内皮细胞体外损伤模型的建立

2.3 rAAV9-eGFP-R65转染内皮细胞对其增殖和凋亡的影响

2.4 AAV9介导R65核酶基因对NF-κB通路相关蛋白表达的影响及转录因子活性的检测

2.5 rAAV9介导R65基因转染减轻低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡的检测

2.6 统计学方法

结果

1重组腺相关病毒体外转染效率的测定

1.1人脐静脉内皮细胞和人主动脉平滑肌细胞的培养

1.2重组腺相关病毒转染后HUVECS、HASMCS中eGFP表达及细胞生长形态观察

1.3 流式细胞术检测细胞的转染效率

2 内皮细胞体外损伤模型的建立

2.1 ox-LDL诱导HUVECs体外损伤模型建立

2.2 高脂血清诱导内皮细胞体外损伤模型的建立

3 NF-κB通路相关蛋白表达及转录因子活性的检测

3.1免疫荧光定位检测NF-κB通路相关信号分子的转位激活

3.2 Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白P65、P50的表达

3.3 ELISA法检测内皮细胞中TNF-a、IL-6、vWF和eNOS的水平变化

4 rAAV9介导R65基因转染减轻ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡的检测

5 rAAV9-eGFP-R65转染内皮细胞对其增殖和凋亡的影响

5.1 细胞增殖结果

5.2 细胞凋亡结果

讨论

小结

致谢

参考文献

综述

攻读硕士期间发表的学术论文

新疆医科大学硕士/博士研究生学位论文导师评阅表