视神经损伤后的病理溃变及手术及药物干预的实验研究

摘要

目的：
　　视神经损伤是颅脑、面部和眼眶外伤严重的并发症，受伤后视力损害严重，经常遗留永久性视力障碍。长期以来，关于视神经损伤的治疗一直存在着争议。现有研究认为，使用糖皮质激素为主的药物治疗法和手术治疗法是最常用的治疗手段，视神经管减压术已成为目前主要的手术治疗方法,视神经减压术是解除直接压迫，缓解神经肿胀及血管痉挛，对于视神经损伤有一定的疗效；地塞米松对于视神经损伤有着皮质激素可通过其抗氧化作用减轻自由基对细胞膜结构的损伤而使水肿减轻,同时阻断外伤性炎症介质及血管活性物质的产生，从而减轻血管痉挛，降低视神经挫伤性坏死的严重性以及微循环血管痉挛程度的作用。以往实验偏向于动物模型制作，对临床指导作用缺乏。本实验以视神经减压术、地塞米松药物治疗及视神经减压术联合地塞米松药物治疗为影响因素，以视神经 Nogo受体，视网膜 Nogo受体、Caspase-3为切入点，对兔视神经损伤模型的视网膜及视神经受体进行光镜及电镜下病理生理观察。初步明确视神经减压术、地塞米松药物治疗及视神经减压术联合地塞米松药物治疗对于视神经模型的影响。为临床视神经治疗提供理论基础。通过假伤组与对照组验证本实验设计合理性。通过临时动脉瘤夹闭视神经制造可用于视神经损伤手术或药物治疗的观察研究稳定的的动物模型。
　　方法：
　　(1)实验动物分组：
　　成年健康白兔96只，种属为新西兰白兔，体重2-2.5kg，由新疆医科大学医学动物中心提供。适应性喂养3d后检查双侧眼，发现屈光间质清，瞳孔等大、等圆，对光反射灵敏，眼底无异常；其中6只为空白对照组，18只为假伤组，以排除手术因素对视神经及视网膜的影响，对剩余72只白兔左眼进行视神经损伤模型制作，随机分为模型组、单纯视神经损伤组，地塞米松药物治疗影响组、视神经减压术影响组、视神经减压术联合地塞米松药物治疗共同影响组四个大组，每个大组分为三个亚组，分别为术后1天组、7天组、21天组，每个亚组6只。
　　(2)动物模型的制作
　　3％戊巴比妥1ml/kg耳缘静脉注射麻醉白兔后，俯卧位固定于手术台;在双目显微镜下，上睑外侧置一牵引缝线，固定以牵开上睑;剪开球结膜，在上直肌及上斜肌肌止端处作牵引缝线;将眼球向眶前外下方向拉，显微镜下锐性分离球后软组织，以暴露视神经，向深部分离视神经约8mm，于球后3mm处用动脉瘤夹（蛇牌临时动脉瘤夹 FT250T,咬合长度9mm，最大开口7mm，闭合力0.88N,重量：9克。）夹闭20s（假伤组不夹闭视神经）。将眼球复位、缝合球结膜。生理盐水冲洗眼眶，滴加左氧氟沙星滴眼液。动物模型建立标准：视神经损伤动物模型建立术后，待苏醒后放回笼内，检查手术切口愈合良好，无化脓积脓，无渗血渗液，观察伤眼瞳孔散大，直接对光反应消失，术眼角膜透明、无外伤性白内障发生、玻璃体腔无积血、视网膜血液供应正常无出血和视网膜脱离发生、术眼玻璃体无炎性反应、视网膜血管无出血及梗塞，无眼球突出及眼睑闭合，不全者纳入实验。经以上各项评价指标检测反映该模型建立成功与否。经上述标准检查，96只新西兰白兔的视神经动物模型随机分批纳入实验。动物饲养过程中，对于出现并发症者排出实验，并及时补足实验动物数目。
　　(3)视神经减压术
　　按照实验分组，对于需要实行视神经减压术的实验动物，按上述模型制作方法制作模型，动脉瘤夹夹闭20s后，采用1ml注射器针头显微镜下分离视神经外包膜组织至球后神神经8mm处，达到视神经减压目的。
　　(4)地塞米松给药方法
　　所有地塞米松影响实验动物，于术后当日开始，按每日每只1mg/kg剂量，进行肌肉注射，直至达到各处死节点。
　　(5)视神经及视网膜神经节细胞层标本采集及其形态学研究：
　　采用3%戊巴比妥钠麻醉过量麻醉，开胸经左心室插管至主动脉，上腔静脉开口排出灌注液，依次灌注生理盐水500ml，2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液250 ml，至兔子出现四肢抽搐强直后，立即摘除眼球取视神经视网膜标本置于固定液中，并标记，光镜标本用4%多聚甲醛固定72h、脱水、石蜡包埋,通过视神经乳头，沿眼球的垂直经线行前后方向视网膜全层进行切片，行 HE染色。使用切片机制备切片。RGC计数方法：用光学显微镜（40物镜）观察，每个标本随机抽取3张切片，距离视神经乳头上方和下方300um分别3个区域（每个区域25um*25um），统计存活的视网膜神经节细胞数目的总和。计算视网膜神经节细胞数总和然后取平均数并记录实验数据，最后利用统计学软件分析各组不同时间点视网膜神经节存活的细胞数，其凋亡规律以及各组是否存在统计学差异。
　　电镜标本：将视神经标本用4%戊二醛电镜固定液固定。冰箱恒温保存，于电镜室4%戊二醛和1%四氧化锇双重固定，丙酮梯度脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB2188超薄切片机切片，铅铀电子染色，JEOL1230透射电子显微镜观察。
　　(6)观测指标及时间点
　　观察指标：夹闭后1天、一周、3周观察：1）夹闭后局部视网膜及视神经组织形态学光镜观察，及视神经超微结构的电镜观察；2）视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)计数（细胞原位凋亡技术检测）；3）视网膜上Caspase-3的免疫组化检测；4）视神经、视网膜 Nogo受体的免疫组化检测，病理免疫组化结果进行相关性分析视神经减压术及地塞米松对于视神经模型的影响。
　　(7)统计学分析：统计资料为多组定量资料，若分组或时间符合正态、方差齐性，进行方差分析，若不符合，使用 Kruskal-wallis(KW)秩和检验。同时进行不同分组及不同时间的两两比较各组数据用sas jmp pro计算机统计软件进行统计学分析。各组的计量资料以均数±标准差表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。表中*为不符合方差齐性，使用Wilcoxon秩和检验
　　结果:
　　(1)组织形态学光镜观察，采用HE染色法视神经损伤后，光镜下观察，早期视网膜出现肿胀，各层厚度较正常略增厚，细胞排列疏松而紊乱，仅见视网膜毛细血管扩张，视网膜神经节细胞少量减少。
　　视网膜H E染色组织形态学观察对照组视网膜层次清晰，R G C呈单层排列，整齐密集，胞核清楚，核膜光滑完整，各时间点损伤病理改变明显，病变随时间推移进行性加重。损伤一天组视网膜形态改变，细胞轻度水肿，厚度稍变厚，神经节细胞层内外层排列稍紊乱，细胞间隙增大，有少量核固缩，染色加深，大量节细胞空泡变性，细胞数量稍微减少。损伤一周组视网膜形态改变，较前一组加重，细胞水肿严重，神经节细胞核染色质深染加重，可见大量空泡变性的细胞，外层和内层结构紊乱，界限模糊不清，视网膜全层明显变薄。损伤三周组，视网膜细胞水肿改变较之前有所减轻，核质染色深染，各层结构紊乱，视网膜全层变薄。
　　(2)视神经超微结构的电镜观察1天（图3-1）神经纤维轻微变形，髓鞘板层结构轻度分离，局部可见泡状结构，可见球状突向轴浆，髓鞘板层结构分离，轴浆神经原纤维排列松散，以粗纤维为主，血管内皮细胞肿胀,管腔不全阻塞,神经纤维破碎,髓鞘塌陷等急性创伤改变排列不齐少量线粒体轻微肿胀。7天（图3-2）髓鞘松解，髓鞘普遍变性,洋葱样小体形成,胶质明显增生,仍残留有水肿软化小区厚度增加，板层结构分离层多层，个别表现为脱髓鞘。胶质细胞轻微肿胀，线粒体空泡变，部分神经轴浆空泡变。21天（图3-3）神经变性，神经纤维结构不规则，髓鞘结构紊乱明显，可见鞘膜泡状解离，部分纤维轴浆空泡变，水肿软化灶消失,由胶质代替.各治疗组无特殊变化。
　　(3)视网膜神经节细胞在急性视神经损伤模型建立后视神经减压术治疗在（1d）有差异（P＜0.05），且有统计学意义。地塞米松、视神经管减压术，两者有差异（P＜0.05）具有统计学意义。视神经减压术、地塞米松及减压地塞米松三种治疗组与单纯损伤组在7天、21天个时间点均无差异（P＞0.05），且无统计学意义。
　　(4)视网膜上Caspase-3的免疫组化的检测
　　视神经减压术、地塞米松及减压地塞米松三种治疗与单纯损伤组在1天时间点有差异（P＜0.05），且具统计学意义。与单纯损伤组在7天、21天个时间点均无差异（P＞0.05），且无统计学意义。
　　(5)视神经视网膜Nogo受体的免疫组化检测
　　Nogo-A在正常成年大鼠视神经和视网膜中广泛分布。急性视神经损伤可以促使 Nogo-A表达上调。视神经减压术、地塞米松及减压地塞米松三种治疗与单纯损伤组在1天时间点有差异（P＜0.05），且具统计学意义。与单纯损伤组在7天、21天个时间点均无差异（P＞0.05），且无统计学意义。
　　结论：
　　(1)本研究通过临时动脉瘤夹闭视神经,制造稳定的、可重复，易操作的可用于视神经损伤手术或药物治疗观察研究的动物模型，通过假伤组视神经及视网膜神经节细胞及特殊分子生物学表达的统计学分析，假伤组与对照组验证本实验设计合理,可较好的运用视神经损伤实验动物造模，
　　(2)本研究结果显示：急性视神经损伤后 RGC凋亡是一个随时间进行而发生的持续细胞凋亡过程。单纯夹闭组与3组治疗组在光镜电镜病理形态变化上无明显差别。
　　(3)急性视神经损伤可以促使 Caspase-3阳性表达上调，表明 Caspase-3可能在视神经损伤的神经再生过程中发挥着重要作用。Nogo-A在正常成年大鼠视神经和视网膜中广泛分布,急性视神经损伤可以促使Nogo-A表达上调，表明Nogo-A可能在视神经损伤的神经再生过程中发挥着重要作用。
　　(4)在急性视神经损伤模型建立后视神经管减压术治疗、地塞米松及减压地塞米松治疗可在早期（1d）防止急性视神经损伤后 RGC层和内核层细胞凋亡，而在7天21天时间点对急性视神经损伤后视神经及视网膜作用无明显差异，P＞0.05，且无统计学意义，三种治疗对急性视神经损伤后 RGC层和内核层细胞具保护作用不确定。
　　(5)本研究结果显示：视神经管减压术其治疗效果可能等同地塞米松组及减压地塞米松组，这一实验结果从不同角度解释了三种治疗方法能减少视神经损伤后视神经视网膜神经节细胞的凋亡数目，但其确切机制需要进一步的研究。这一实验结果尚需进一步的分析。但三者存在的差异仍需进一步研究。

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 视神经减压术及地塞米松对兔视神经损伤模型形态学病理影响

1研究内容和方法

2结果

3讨论

4小结

第二部分 视神经减压术及地塞米松对兔视神经损伤模型视网膜Caspase-3表达影响

1研究内容和方法

2结果

3讨论

4小结

第三部分 视神经减压术及地塞米松对兔视神经损伤模型视神经视网膜Nogo-A受体表达影响的研究

1研究内容和方法

2结果

3讨论

4小结

结论

致谢

参考文献

附录

综述

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表