肝素促进转化生长因子-β3体外诱导兔牙髓干细胞成骨向分化能力的研究

摘要

目的：应用酶解组织块儿法分离，培养兔牙髓干细胞的基础上探讨肝素对转化生长因子(transforming growth factor)-β3在体外诱导兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)成骨向分化的能力。
　　方法：新西兰幼兔4只，采用酶解组织块法分离培养兔DPSCs，传代培养至第3代兔DPSCs,分别以含0,5u/mL,10u/mL,20u/mL肝素的培养基培养兔DPSCs,绘制生长曲线，筛选最适浓度的肝素后成骨诱导实验分为空白对照组、TGF-β3组，肝素组和TGF-β3+肝素组，空白对照组正常培养,TGF-β3组在细胞培养基中加入20μg/L TGF-β3，肝素组在培养基中加入5u/mL肝素，TGF-β3+肝素组在细胞培养基中同时加入20μg/L TGF-β3和5 u/mL肝素。各组采用碱性磷酸酶（alkailine phosphate,ALP）试剂盒检测兔DPSCs成骨向诱导后第7、14天细胞内ALP活性，细胞爬片采用免疫细胞化学法检测成骨细胞标记物RUNT相关转录因子2（runt related transcription factor2,RUNX-2）和骨钙素（osteocalcin,OC）表达情况，采用茜素红染色观察矿化结节形成情况，对肝素组行免疫荧光定量PCR检测RUNX-2，BSP等成骨相关基因mRNA的相对表达量。
　　结果：通过酶解组织块儿法获取的兔牙髓干细胞在诱导体系中生长良好。连续9天的培养后，肝素对兔 DPSCs增殖表现为从10u/mL开始有明显的抑制作用，而5u/mL肝素组跟空白对照组没有差异，说明5u/mL肝素对兔DPSCs增殖没有抑制作用，即该浓度肝素对DPSCs没有损害性。TGF-β3+肝素组第7,14天 ALP活性[(27.20±1.01),（29.06±1.39）u/mg·pro]明显高于TGF-β3组[(12.69±1.03),（9.44±1.05）u/mg·pro]和对照组[(5.96±3.68)、(6.10±3.66)u/mg·pro]（P<0.01），TGF-β3组明显高于对照组（P<0.001）；TGF-β3组，肝素组和TGF-β3+肝素组成骨诱导第7天RUNX-2开始出现阳性表达，第14天TGF-β3组,TGF-β3+肝素组OC有阳性表达，对照组和肝素组为阴性；第21天茜素红染色对照组和肝素组为阴性，TGF-β3组为阳性，TGF-β3+肝素组为强阳性,PCR结果显示较对照组肝素组有RUNX-2 mRNA表达量上升，而BSP mRNA表达量没有上升。
　　结论：肝素有促进TGF-β3体外诱导兔DPSCs成骨向分化的能力。

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封面

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中文摘要

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前言

研究内容与方法

1 研究对象

2 主要试剂和仪器

3 实验方法

4 质量控制

5. 数据统计分析

结果

1 最适浓度肝素的优选

2 ALP定量检测

3 免疫细胞化学检测

4 组茜素红染色结果

5 RT-qPCR结果

讨论

1 牙髓干细胞在颌面部组织再生重建的应用

2 TGF-β3 概况及其在组织工程研究中的应用

3 肝素与间充质干细胞在组织工程研究中的应用

小结

致谢

参考文献

综述:牙髓干细胞的多向分化能力在组织工程研究中的应用

攻读硕士学位期间发表的学位论文

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