桃果实发育硬核期蛋白质双向电泳方法的建立及应用

摘要

蛋白质是生命功能的执行体，蛋白质组学是研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成及其变化规律的科学。双向电泳作为蛋白质组研究的三大核心技术之一，是目前常用的唯一一种能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，广泛应用于生物学研究的各个方面。随着桃果实表达序列标签的完善，桃果实发育的功能基因组学研究迎来了新的机遇。本实验以“久保”桃(Prunus persicaL．cv．Okubao)中果皮为试材，通过比较不同上样量、不同上样缓冲液、不同胶条平衡缓冲液、不同pH范围固相pH梯度(immobilized pH gradients，IPG)胶条、不同染色方式等因素对双向电泳图谱效果的影响，试图建立一套适用于桃果实蛋白质组学分析的双向电泳方法。实验结果表明采用17cm的IPG胶条，90μg蛋白上样量，样品干粉溶于375μL含有尿素、硫脲、CHAPS、磺基三甲基胺乙内脂10、两性电解质等成分的水化上样缓冲液中，等电聚焦后用含有磷酸三丁酯的胶条平衡缓冲液一步平衡，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后的电泳图谱效果较好，但银染色得出的双向电泳图含有更多的蛋白质点，且背景清晰，适用于桃果实蛋白质组分析。继而采用pn 5.0～8.0的17 cmIPG胶条并应用以上方法对桃果实发育过程中硬核期的中果皮和内果皮进行蛋白质双向电泳分析，发现中果皮双向电泳图谱含有蛋白质点1318±125个，内果皮双向电泳图谱含有蛋白质点1415±133个，两张图谱相比较至少存在24.77﹪的差异，随后的蛋白质鉴定将利用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱来完成。

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1植物果实发育及成熟的研究

1.1.1植物果实发育概述

1.1.2植物果实发育与成熟的调控

1.1.3果实发育及成熟中品质形成相关物质的研究动态

1.2蛋白质组学研究技术及其应用现状

1.2.1蛋白质组学的研究背景及意义

1.2.2蛋白质组学的概念与研究内容

1.2.3蛋白质组学在各研究领域的应用

1.2.4蛋白质组学在果树中的应用

1.3蛋白质组学研究的相关技术

1.3.1样品的制备

1.3.2双向电泳技术简介

1.3.3双向电泳图谱的染色技术

1.3.4图像分析技术

1.3.5蛋白质的鉴定技术简介

1.3.6蛋白质数据库

1.3.7蛋白质组技术的高流通量筛选规模

1.4本研究的选题依据及意义

第二章材料与方法

2.1仪器与试剂

2.1.1主要仪器

2.1.2试剂

2.2材料与方法

2.2.1样品制备

2.2.2双向电泳

2.2.3凝胶图像的采集

2.2.4图像的分析

第三章结果与分析

3.1蛋白质定量的标准曲线绘制

3.2不同因素对双向电泳影响的比较

3.2.1不同上样缓冲液对考马斯亮蓝染色2-DE图谱影响的比较

3.2.2不同上样缓冲液对银染色2-DE图谱影响的比较

3.2.3不同胶条平衡缓冲液2-DE图谱影响的比较

3.2.4不同染色方式对2-DE图谱影响的比较

3.2.5不同上样量对2-DE图谱影响的比较

3.2.6不同pH范围IPG胶条对双向电泳图谱影响的比较

3.3桃果实发育硬核期中果皮、内果皮2-DE图谱的分析

3.4桃果实发育硬核期中果皮、内果皮差异蛋白点的比较

第四章讨论

4.1桃果实蛋白质双向电泳的影响因素

4.1.1样品制备

4.1.2胶条平衡缓冲液对2-DE的影响

4.1.3上样量对2-DE的影响

4.1.4不同范围的IPG胶条对2-DE的影响

4.1.5图谱背景上的条纹

4.1.6染色

4.2桃中果皮与内果皮蛋白质的差异表达

第五章结论

5.1适用于桃果实蛋白质组分析的双向电泳技术

5.2桃果实发育硬核期中果皮、内果皮2-DE图谱的差异

参考文献

致谢

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