彗星试验方法研究和在医药安全评价上的应用

摘要

彗星试验(Comet assay)又称单细胞凝胶电泳试验(SCGE)，是一种用于测定、研究单个细胞DNA断裂的新电泳技术。由于其具有简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记等特点，有极高的使用价值。其用于检测遗传毒性的敏感性与Ames试验相当，因此应用前景十分广泛。本文在建立该方法的基础上，将此方法扩展应用到医药安全性评价中。本研究依据’lice等(2000年)建立的国际性试验指导原则，采用医药人参皂苷Rg3冻干粉针为受试物，设3个试验剂量组，分别为140、70、35μg/ml、阴性对照组和以甲基磺酸甲酯(MMS)为阳性对照物的2个阳性对照剂量组，分别为1.1×10<'-3>、11×10<'-3>μg/ml，处理CHL细胞2h后，对CHL细胞进行单细胞凝胶电泳试验。从细胞的彗星图和试验数据分析可以看出，阴性对照组和人参皂苷Rg3冻干粉针各试验剂量组的受试细胞DNA均无明显损伤。阳性对照组细胞出现明显彗星，并随着MMS浓度的增大，彗星尾长明显增长，说明MMS浓度越高，对CHL细胞DNA的损伤越严重，且不同浓度MMS与CHL细胞的DNA损伤之间存在着明显的剂量效应关系且有可重复性。结果表明人参皂苷Rg3冻干粉针对CHL细胞DNA无明显损伤作用。且利用此方法检测人参皂苷Rg3冻干粉针无明显遗传毒性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

独创性声明及关于学位论文使用授权的说明

前言

1 彗星试验的研究进展

1.1彗星试验的发展史

1.2彗星试验的试验方法

2彗星试验的应用

2.1遗传毒理学研究

2.2职业环境监测

2.3环境生态监测

2.4彗星试验在农药遗传毒性研究中的应用

2.5医学诊断和药物治疗中的应用

3 彗星试验技术展望

4.材料与方法

4.1材料

4.1.1实验对——CHL细胞

4.1.2受试物——人参皂苷Rg3冻干粉针

4.1.3阳性对照物质——甲基磺酸甲脂(MMS)

4.1.4相关试剂

4.1.5相关仪器

4.2方法

4.2.1细胞培养

4.2.2试剂配制

4.2.3凝胶制片

4.2.4各层胶面琼脂糖用量的选择

4.2.5琼脂糖浓度的选择

4.2.6剂量设计

4.2.7染毒

4.2.8细胞生存率的测定

4.2.9细胞溶解

4.2.10强碱性(pH＞13)DNA解旋

4.2.11电泳

4.2.12中和

4.2.13染色

4.2.14 SCGE检测不同浓度受试物和阳性对照物对CHL细胞的作用

4.2.15镜检与数据处理

5.结果与分析

5.1不同胶面琼脂溶液用量的选择

5.2琼脂糖溶液浓度的选择

5.3玻片的选择

5.4制胶板

5.5制胶环境温度

5.6制片凝胶体的最佳条件

5.7两种不同染毒方式的比较

5.8染毒前、后细胞存活率测定结果

5.9细胞裂解

5.10 DNA 解旋

5.11 DNA电泳

5.12不同浓度受试物作用于CHL细胞彗星电泳图像

5.13不同浓度阳性对照物MMS对CHL细胞DNA损伤的彗星图

5.14不同浓度阳性对照物MMS对CHL细胞DNA迁移的效应

6.讨论

6.1彗星试验方法

6.1.1凝胶制片

6.1.2细胞溶解

6.1.3强碱性(PH＞13)DNA解旋

6.1.4电泳

6.1.5染色

6.1.6镜检

6.2体外染毒

6.3彗星主要计算指标

6.3.1形状指标

6.3.2距离指标

6.3.3强度指标

6.3.4“矩”类指标

6.4彗星试验的应用前景

结论

参考文献

附录

致谢

作者简历