转抗虫、抗除草剂烟草和棉花的研究

摘要

随着现代农业的发展，绿色、环保、省时省力的新型农业越来越受到广大农民的欢迎，因此复合性状的转基因作物也应运而生。虫害是严重影响我国农业发展的重要因素，经常造成作物的大量减产；同时近年来，杂草争夺作物的水分和养分，滋生病害和虫害，影响作物品质和产量。因此研究转抗虫、抗除草剂基因作物对我国农业发展有重要意义。 本研究就是将CaMV35S启动子驱动GFMCrylA和CPTI融合抗虫基因的表达盒和RUBP启动子驱动EPSPS抗除草剂基因的表达盒共同转入植物表达载体pGBll21上，获得既抗虫又抗除草剂的植物表达载体pGBIF4ABCRUBPEPSPS，通过农杆菌介导法转化了烟草，共获得了45株再生植株，在移栽过程中共成活29株，随机挑选10株提取叶片基因组，进行PCR扩增，结果得到8株双阳性植株，转化效率达到80％。Southern结果表明农杆菌介导法大部分为单拷贝，只有3号植株出现双拷贝。在对其进行进一步草甘膦抗性分析中发现：转基因烟草的叶片可以在含有高达1mmol草甘膦的MSB培养基上长出愈伤，并且能在0.03mmol草甘膦培养基上长出再生芽，在0.05mmol的草甘膦培养基上获得再生。 通过花粉管通道法，用pGBIF4ABCRUBPEPSPS质粒注射棉花5700朵花，收获种子后，对T1种子进行海南繁殖，经kna(卡那霉素)筛选鉴定获得10株kna阳性植株，对卡那阳性植株进行PCR扩增，直接测序并进行了序列比对，最终获得7株转双基因植株。同时为了拓展棉花组织培养的基因型，也为了棉花组织培养提供更多优良的种质材料，我们也对陆地棉优良品种Y18农杆菌介导的再生体系进行了探索，结果表明：(1)在对外植体消毒上采用氯化汞(0.1％)消毒5min，无菌水洗4-5次，不仅能有效地防止污染，又对无菌苗的出苗率及生长不会有影。(2)在对外植体培养天数上，以5-7天的无菌苗最好，易被农杆菌浸染，同时还有利于诱导愈伤，还不会造成材料浪费。(3)Kna筛选浓度试验表明：当Kna浓度为110mg/L时，能完全杀死外植体，所以确定110mg/L为棉花Y18筛选浓度。(4)确定了农杆菌浸染浓度和时间。试验表明处于对数期的农杆菌即OD在0.3-0.6时浸染5分钟效果最好。(5)培养基优化愈伤诱导培养基：MSB+IBA0.8 mg/L，KT0.4 mg/L，pH值6.0；胚性愈伤诱导培养基：MSB*+IBA0.4 mg/L，KT0.2 mg/L，pH值6.5；胚状体和再生苗培养基：MSB*+IBA0.4 mg/L，KT 0.2 mg/L，Asp、Gln各1g/L，活性炭1.5g/L，pH值6.2。IBA0.8和Kt0.4更适合该品种，虽然该激素组合愈伤生长慢，且易生根，但长出愈伤分化率高，后期有利于分化。在愈伤分化阶段IBA0.4mg/L和Kt0.2mg/L组合分化率是最高的，在胚状体诱导阶段其诱导率也要好于其它组合，所以在胚性愈伤阶段以及在胚状体诱导分化阶段使用IBA0.4mg/L和Kt0.2mg/L将是最好的选择。 结合本实验室的研究，对抑菌蛋白在棉花、烟草中的应用也作了初步研究，结果发现：用0.1％氯化汞处理5min后，用无菌水洗3-5次，再用0.12mg/ml抑菌蛋白溶液浸泡棉花去壳种子能有效地防止棉花组织培养中常见的真菌污染，且对棉花根系的发育没有影响，同时在愈伤诱导阶段使用抑菌蛋白对棉花愈伤没有影响：在烟草组织培养中使用抑菌蛋白对愈伤及芽和芽再生没有影响。单独使用抑菌蛋白对细菌的杀菌效果没有抗生素好，但是抑菌蛋白与抗生素配合使用能有效地防止细菌污染，经初步研究抑菌蛋白可以应用于棉花、烟草组织培养，并对组织培养中的污染有良好的防治效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1植物基因工程概况

1.2转基因作物发展概况

1.3转基因植物分类

1.4棉花基因工程的研究进展及意义

1.4.1根癌农杆菌介导法

1.4.2基因枪法

1.4.3花粉管通道法

1.5抗虫转基因研究进展

1.5.1 Bt毒蛋白基因

1.5.2其它抗虫基因

1.6抗除草剂研究进展

1.6.1草甘膦及其特性

1.6.2草甘膦的作用机理

1.6.3抗草甘膦研究进展

1.7本研究目的意义

第二章植物表达载体pGBIF4ABCRUBPEPSPS构建

2.1植物表达载体图谱及构建技术路线

2.2材料与方法

2.2.1试验材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1 pGBIRUBPEPSPS酶切鉴定

2.3.2 pGF4ABC质粒鉴定回收及载体pGBIRUBPEPSPS回收

2.3.3大肠杆菌阳性克隆的筛选

2.3.4 pGBIF4ABCRUBPEPSPS植物表达载体导入农杆菌的PCR鉴定

2.4 小结

第三章抗虫、抗除草剂烟草、棉花的获得及检测

3.1材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌株

3.1.3试剂

3.1.4人工合成的寡核苷酸片段

3.2方法

3.2.1烟草组织培养用相关培养基

3.2.2侵染烟草的农杆菌的准备

3.2.3农杆菌介导的烟草遗传转化方案

3.2.4含有pGBIF4ABCRUBPEPSPS质粒DNA的大量制备

3.2.5花粉管通道法转化棉花

3.2.6转基因植株的Kna筛选

3.2.7烟草、棉花总DNA的提取

3.2.8 PCR鉴定转基因植株

3.2.9 Southern杂交分析

3.2.10.转基因烟草的生物测试

3.3结果与分析

3.3.1烟草外植体的转化及再生植株的获得

3.3.2再生植株的PCR检测

3.3.3转基因烟草southern检测

3.3.4.转融合杀虫基因烟草对棉铃虫的杀虫活性检测

3.3.5转基因烟草的抗草甘膦组织培养检测

3.3.6转基因烟草叶片草甘膦抗性检测

3.3.7花粉管通道法转化棉花

3.3.8棉花Kna抗性植株的PCR检测

3.4 小结

第四章棉花Y18农杆菌介导法转化体系的优化

4.1材料

4.1.1植物材料

4.1.2菌株

4.1.3试剂

4.2方法

4.2.1培养基及配制

4.2.2激素的配制方法

4.2.3棉花组织培养用系列培养基

4.2.4农杆菌介导的棉花下胚轴的遗传转化

4.3结果与分析

4.3.1最佳消毒方法的确定

4.3.2最佳消毒时间的确定

4.3.3无菌苗培养天数的确定

4.3.4 Knan筛选浓度的确定

4.3.5农杆菌浓度和感染时间对外植体愈伤诱导的影响

4.3.6不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

4.3.7不同激素组合对胚性愈伤诱导的影响

4.3.8不同激素组成对胚状体诱导及再生的影响

4.4 小结

第五章抑菌蛋白在棉花、烟草组织培养中的应用

5.1材料与方法

5.1.1植物材料

5.1.2植物组织培养杀菌剂及试剂

5.1.3培养基成分

5.1.4不同的方法制备无菌苗

5.1.5抗菌肽对棉花根系的影响及最佳的抑菌浓度

5.1.6抗菌肽对棉花愈伤的影响

5.1.7不同的抑菌剂对烟草污染的防治效果比较及对愈伤的影响

5.1.8抗菌肽对烟草再生芽生根的影响

5.2结果与分析

5.2.1不同的方法制备无菌苗

5.2.2不同浓度的抗菌肽对棉花根系的影响及最佳抑菌浓度

5.2.3抗菌肽对棉花愈伤的影响

5.2.4不同的抑菌剂对烟草污染的防治些效果比较及对愈伤的影响

5.2.5抗菌肽对再生烟草生根的影响

5.3小结

第六章讨论和结论

6.1讨论

6.1.1植物表达载体构建的研究

6.1.2抗虫、抗除草剂基因转化烟草、棉花的研究

6.1.3棉花Y18农杆菌介导的转化体系优化

6.1.4抑菌肽在棉花烟草组织培养中的应用

6.2结论

6.3创新点

参考文献

致 谢

作者简历