绵羊卵泡液双向电泳图谱构建与差异蛋白质组学分析

摘要

绵羊多年来一直是新疆畜牧养殖的主要畜种，除了推广科学的饲养技术外，提高绵羊繁殖能力是促进养羊业发展的主要途径。绵羊的快繁技术体系中，获得高质量的卵母细胞及提高卵母细胞体外发育成熟的能力是体外胚胎生产技术的关键。卵泡液为卵母细胞的生长发育提供了微环境，对卵泡液进行蛋白质组学方面的研究，有助于找出影响卵母细胞发育成熟的关键蛋白。
　　本研究从样品处理、凝胶浓度、胶条规格、上样量以及染色方法等多方面优化了影响绵羊卵泡液双向电泳图谱质量的因素，构建了适合绵羊卵泡液的双向电泳体系，为后续绵羊卵泡液蛋白质的分离提供了良好的实验基础;以绵羊不同直径卵泡中的卵泡液、激素诱导羔羊和成年羊发育卵泡液为样品，利用双向电泳技术，研究了不同直径卵泡液之间蛋白质组的表达差异和激素诱导羔羊和成年羊发育卵泡液之间蛋白质组的表达差异，切取差异明显的蛋白点进行酶解、质谱鉴定和数据库比对，通过查阅文献分析这些蛋白与卵泡发育和卵母细胞成熟之间的内在联系，以期在蛋白质水平上更加深入地了解绵羊的生殖发育机理，从而改进和推广绵羊良种快繁技术，促进养羊业的持续稳定发展。本研究的结果如下:
　　1、绵羊卵泡液样品处理采用PierceTM Albumin Depletion Kit去除高丰度白蛋白，使用12.5％的丙烯酰胺凝胶，18cm、pH3-10的Immobiline DryStrip胶条对卵泡液样品进行蛋白分离，当上样量为250μg时得到的2-DE图谱蛋白分离效果好，分辨率高，清晰度好。另外，样品胶使用考马斯亮蓝胶体染色法，灵敏度高，与质谱兼容性好，利于差异蛋白点的切取和鉴定;
　　2、对采集自绵羊卵巢＜3mm、3-5mm、＞5mm不同直径卵泡的三组卵泡液样品采用双向电泳技术进行差异蛋白质组学分析。结果显示:不同直径组卵泡液样品的2-DE图谱间有298个蛋白点匹配，通过含量计算及统计学分析，确定出17个差异表达蛋白点，经质谱分析有7个差异蛋白被鉴定，分别是:微管蛋白β2A链、丛生蛋白、原肌球蛋白-3、α1-酸性糖蛋白、β-肌动蛋白和白蛋白（其中有两个蛋白点被鉴定为白蛋白）。并且，这6个差异蛋白在直径＜3mm卵泡液组的表达量均高于其他两组;
　　3、使用激素诱导羔羊与成年羊发育卵泡液样品，通过双向电泳技术进行差异蛋白质组学分析，结果显示:激素诱导羔羊与成年羊发育卵泡液样品的2-DE图谱间有384个蛋白点匹配，通过含量计算及统计学分析，确定出16个差异表达蛋白点，经质谱分析，鉴定出6个差异蛋白，分别是:血红蛋白亚基α-1/2（有两个蛋白点被鉴定为该蛋白）、血红蛋白亚基β-c、结合珠蛋白-25同源物1、载脂蛋白A1和结合珠蛋白。其中，血红蛋白亚基α-1/2、血红蛋白亚基β-c、结合珠蛋白-25同源物1在激素处理成年羊发育卵泡液中高表达;载脂蛋白A1和结合珠蛋白在激素处理羔羊发育卵泡液中高表达。

目录

声明

论文说明

摘要

常用缩略语中英文对照表

第1章 引言

1．1 卵泡液概述

1．1．1 卵泡液的产生和组成

1．1．2 卵泡液成分对卵母细胞发育的影响

1．2 蛋白质组学概述

1．2．1 组学时代中蛋白质组学研究的意义

1．2．2 蛋白质组学的分类

1．2．3 差异蛋白质组学研究的主要技术手段

1．2．4 蛋白质组学相关数据库

1．3 差异蛋白组学在动物生殖发育领域的研究进展与应用

1．4 研究的目的意义

第2章 绵羊卵泡液蛋白质组双向电泳体系的构建与优化

2．1 材料与方法

2．1．1 绵羊卵泡液样品的采集

2．1．2 实验药品与试剂

2．1．3 实验仪器与设备

2．1．4 实验相关溶液的配制

2．1．5 绵羊卵泡液样品高丰度白蛋白的去除

2．1．6 绵羊卵泡液样品蛋白质浓度测定

2．1．7 丙酮沉淀蛋白

2．1．8 预制干胶条的水化

2．1．9 第一向等电聚焦(IsoeIectric focusing，IEF)

2．1．10 凝胶的制备

2．1．11 固相pH干胶条的平衡

2．1．12 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．1．13 凝胶染色

2．1．14 凝胶扫描

2．2 结果与分析

2．2．1 两种试剂盒去除绵羊卵泡液高丰度白蛋白效果的比较

2．2．2 不同浓度凝胶对双向电泳图谱影响的比较

2．2．3 不同胶条规格及上样量的比较

2．2．4 不同考马斯亮蓝染色方法的比较

2．3 讨论

2．3．1 样品制备中高丰度蛋白去除对双向电泳图谱质量的影响

2．3．2 不同凝胶浓度对双向电泳图谱质量的影响

2．3．3 不同胶条规格对双向电泳图谱质量的影响

2．3．4 不同上样量对双向电泳图谱质量的影响

2．3．5 不同染色方法对双向电泳图谱质量的影响

2．4 小结

第3章 绵羊不同直径卵泡的卵泡液差异蛋白质组学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 绵羊卵泡液样品的采集

3．1．2 实验药品与试剂

3．1．3 实验仪器与设备

3．1．4 主要溶液配制

3．1．5 绵羊不同直径卵泡卵泡液2-DE图谱构建

3．1．6 凝胶扫描和图像差异分析

3．1．7 差异蛋白点的切取

3．1．8 差异蛋白点的酶解及质谱分析

3．1．9 数据库查询

3．2 结果与分析

3．2．1 绵羊不同盲径卵泡卵泡液2-DE图谱差异蛋白点分析

3．2．2 绵羊不同直径卵泡卵泡液2-DE图谱差异蛋白点鉴定

3．3 讨论

3．4 小结

第4章 激素诱导后羔羊与成年羊发育卵泡的卵泡液差异蛋白质组学分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供体羊激素处理与卵泡液样品的采集

4．1．2 实验药品与试剂

4．1．3 实验仪器与设备

4．1．4 主要溶液配制

4．1．5 激素诱导羔羊和成年羊发育卵泡液2-DE图谱构建

4．1．6 凝胶扫描和图像差异分析

4．1．7 差异蛋白点的切取

4．1．8 差异蛋白点的酶解及质谱分析

4．1．9 数据库分析

4．2 结果与分析

4．2．1 激素诱导后羔羊与成年羊发育卵泡的卵泡液2-DE图谱差异蛋白点分析

4．2．2 激素诱导后羔羊与成年羊发育卵泡的卵泡液2-DE图谱差异蛋白点鉴定

4．3 讨论

4．4 小结

第5章 全文总结及展望

5．1 全文总结

5．2 展望

参考文献

致谢

作者简介