反义TIMP-1真核细胞表达质粒对实验性肝纤维化的体外研究

摘要

背景和目的：肝纤维化(hepaticfibrosis)是多种慢性肝病的共同病理基础，是临床向肝硬化发展的必经环节。目前的研究认为肝纤维化属于可逆性病变。 肝纤维化是由于肝损伤持续存在，组织发生修复时，细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成和降解失衡而引起的病理改变。过度沉积的ECM不仅是由于合成增多，更大程度是由于后期降解减少引起。它涉及复杂的细胞和分子机制的动态过程。其中起主导作用的是基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)-金属蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinase，TIMPs)系统。其中，间质胶原酶MMP-1(人)/MMP-13(鼠)主要降解Ⅰ、Ⅲ型胶原，TIMP-1可广泛抑制MMPs的活性。在正常肝脏，二者维持着动态平衡的状态，在各种致病因素的作用下，导致二者作用失衡，引起以胶原为主的ECM降解减少，沉积于肝脏，引发肝纤维化。 肝纤维化的必经环节是肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)的激活，转变成为肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)。MFB随着肝纤维化进展最终转变成为纤维细胞，这个过程中将分泌大量的ECM。HSC在体外培养可以自行活化，模拟了体内肝纤维化的过程，是很好的肝纤维化模型。HSC活化后合成和分泌大量的ECM和TIMP-1，后者抑制了MMPs的活性，减少了ECM的降解，促进了肝纤维化的进展。由于HSC所处的核心地位，HSC成为了国内外学者研究的热点。本研究旨在分离和培养大鼠HSC，以脂质体包埋反义TIMP-1表达质粒和pcDNA3.1(+)质粒，导入体外培养的大鼠HSC，并筛选阳性细胞，通过免疫组化检测TIMP-1、MMP-13蛋白的表达，纤维细胞计数，RIA法检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP)表达的改变。探讨基因治疗肝纤维化的可行性和有效性，为今后肝纤维化的基因治疗提供理论基础。 材料和方法：1、大鼠HSC的分离和培养：健康Wistar大鼠，麻醉后原位以HBSS冲洗肝脏，接着以胶原酶、链霉蛋白酶灌注，分离肝脏，剪碎，消化，过滤，密度梯度离心，得到HSC。Desmin免疫组化染色鉴定； 2、G418最佳筛选浓度的确定：将G418配制成0-600ug/ml的液体，加至未转染的细胞，培养11d，以7-10d90％细胞致死剂量为最佳筛选浓度，故确定450ug/ml为大鼠HSC最佳筛选浓度，维持量为200ug/ml； 3、Lipofectamine2000脂质体转染并筛选HSC：Lipofectamine2000脂质体包埋反义TIMP-1佃cDNA3.1(+)表达质粒和pcDNA3.1(+)质粒，转染HSC，48h后，以确定的G418最佳筛选浓度450ug/ml筛选，培养18天后，获得阳性克隆，挑选阳性克隆培养； 4、结果观察：免疫组化检测TIMP-1、MMP-13蛋白的表达，并应用计算机图像分析技术半定量检测其蛋白表达的强弱。每组细胞中计数3000个细胞中所含纤维细胞总数。RIA法检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP)表达的改变。实验结果中计量资料采用SPSS11.0软件作单因素方差分析(多样本均数的两两比较)，计数资料采用SPSS11.0作x2检验。 结果：1、大鼠HSC分离和培养成功；2、肝纤维化组，空质粒组，反义TIMP-1质粒组TIMP-1蛋白表达的灰度均值为121.573±5.969，122.507±5.326，142.197±7.887；MMP-13蛋白表达的灰度均值为155.719±9.512，158.598±11.380，178.162±5.941；PⅢNP表达的浓度均值为54.237±8.429,58.213±6.967，32.143±9.478；HA蛋白表达的浓度均值为185.306±8.861，182.277±6.447，78.615±5.269。肝纤维化组与空质粒组相比纤维细胞计数P值结果为0.492，肝纤维化组、空质粒组与反义TIMP-1质粒组相比纤维细胞计数P值结果分别为0.000，0.000；反义TIMP-1质粒组与肝纤维化组、空质粒组相比，TIMP-1、MMP-13、PⅢNP、HA蛋白表达及纤维细胞计数明显减少(P＜0.05)，肝纤维化组与空质粒组无显著性差异(P＞0.05)。 结论：1、大鼠HSC分离和培养成功； 2、反义TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒能够抑制肝星状细胞中TIMP-1的表达3、反义TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒对肝星状细胞中的MMP-13的表达有间接的抑制作用； 4、反义TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒能够减少HA、PⅢNP的表达，减少ECM的沉积； 5、反义TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒对肝纤维化的进展有一定的抑制作用。

目录

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摘要

英文缩略语表

前言

第一部分大鼠肝星状细胞的分离、培养和鉴定

第二部分反义TIMP-1真核细胞表达质粒对实验性肝纤维化的影响

结论与展望

参考文献

综述MMP-1、TIMP-1及其在肝纤维化中的作用

作者简介

致谢

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