绵羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）在毕赤酵母中表达的研究

摘要

抗菌肽是广泛存在于自然界生物体中的多肽,是生物体先天免疫的重要组成部分。因其具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点而广受人们的关注。 绵羊骨髓抗菌肽(SMAP-29)是1995年Bagella和Margherita Zanetti等研究小组在绵羊的骨髓mRNA中发现的,具有两亲性α-螺旋结构域,属于cathelicidins家族,含29个氨基酸残基,有很强的抗细菌、真菌、中和内毒素等生物学功能。 本研究以GenBank发表的SMAP-29基因(L46854)为模板,参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastotls)密码子偏好性,设计合成了抗菌肽SMAP-29成熟肽目的基因片段。通过基因重组的方法将合成的基因克隆入pPIC3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-SMAP-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。将构建成功的载体电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。对构建好的重组酵母表达基因工程菌用甲醇诱导表达,裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2KD的表达带。Trizol法提取酵母总RNA,通过RT-PCR扩增SMAP-29 mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在SMAP-29 mRNA,而对照没有检出,表明SMAP-29在毕赤酵母中存在表达。表达产物经凝胶过滤色谱处理后进行抑菌活性检测,结果表明该表达产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC2592)和白色念珠菌(Candida albicans ATCC2002)有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑制效果不明显。

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论文说明:主要缩略语表

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第一章文献综述

文献综述(一)抗菌肽研究进展

1.抗菌肽的分类：

2.抗菌肽的抗菌机理：

3.抗菌肽的药物开发前景：

4.展望：

文献综述(二)抗菌肽SMAP-29研究进展

1.SMAP-29的结构

2.SMAP-29的基因表达及其调控

3.SMAP-29的作用机理

4.SMAP-29的生物学活性

5.SMAP-29生物活性与结构之间的关系

6.SMAP-29的基因工程表达

7.存在的问题及前景展望

文献综述(三)毕赤酵母表达系统研究进展

1.毕赤酵母表达宿主菌：

2.毕赤酵母表达载体：

3.表达载体与毕赤酵母的转化及整合：

4.外源蛋白在其中的表达：

5.毕赤酵母表达系统与大肠杆菌表达系统的比较：

第二章实验研究

试验一抗菌肽SMAP-29基因密码子优化及其毕赤酵母表达载体的构建

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

试验二转化酵母工程菌及重组抗菌肽的诱导表达

1.材料和方法

2.结果与分析

3.讨论

试验三重组抗菌肽的鉴定及其生物学活性的初步测定

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三章结论

创新点

进一步研究建议

参考文献：

附录

致谢

作者简历