羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90 OMP31 VIRB2基因缺失株的构建和检验

摘要

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人、畜共患传染病。疫苗免疫是预防该病的主要措施。我国研制的羊种布鲁氏菌弱毒苗M5-90对绵羊和山羊布鲁氏菌病的预防和控制起到了重要的作用，但在使用中有副作用大、保护力有限、不能区分疫苗免疫和自然感染的个体的缺陷。布鲁氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系统家族蛋白是公认的毒力因子。本研究通过敲除布鲁氏菌弱毒苗M5-90外膜蛋白OMP31基因，Ⅳ型分泌系统家族蛋白VIRB2基因，使弱毒苗的毒力降低，为该病的预防提供更为安全的疫苗奠定基础。同时针对要改造的基因及其编码蛋白，建立鉴别诊断方法，能有效区分疫苗免疫和自然感染的动物个体，有利于净化和控制疾病。 本研究分别应用聚合酶链式反应克隆出包括OMP31基因及其上下游同源臂的序列，包括VIRB2基因及其上下游同源臂的序列，从枯草杆菌克隆果聚糖蔗糖酶基因sacB，从质粒得到氯霉素抗性基因（CAT），应用叠合PCR用CAT基因替换OMP31；酶切方法把VIRB2基因切除，与载体Pgem-7zf（-）连接，在同源臂外侧连接sacB基因，构建好自杀载体。把自杀载体电转化入布鲁氏菌M5-90感受态中，自杀载体的同源臂与布鲁氏菌发生同源同组，分别用氨苄布鲁氏菌平板筛选一次交换子，用5％蔗糖布鲁氏菌平板二次筛选缺失菌。用聚合酶链式反应（PCR）鉴定得到敲除OMP31基因的菌和敲除VIRB2基因的菌。通过基因工程构建OMP31原核表达载体，在大肠杆菌中表达并检测其免疫原性。通过研究分别获得了缺失外膜蛋白OMP31基因和Ⅳ型分泌系统家族蛋白VIRB2基因的羊种布鲁氏菌M5-90；OMP31基因，VIRB2基因的缺失菌传10代，遗传稳定；原核表达的OMP31蛋白免疫原性好。构建的OMP31 VIRB2基因羊种布鲁氏菌M5-90基因缺失株为新型疫苗的研究奠定了基础。表达的OMP31蛋白为建立从抗体水平区分自然感染和疫苗免疫方法提供了抗原。

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前言

第一章 文献综述 布鲁氏菌毒力因子和疫苗的研究进展

1布鲁氏菌的毒力因子研究进展

1.1控制脂多糖(LPS)合成的基因

1.2超氧化物歧化酶

1.3布鲁氏菌基因OMP31

1.4Ⅳ型分泌系统

1.5其他毒力因子

2布鲁氏菌疫苗研究进展与展望

2.1羊型Key.l弱毒活菌苗

2.2 S19(牛型19号)弱毒活菌苗

2.3猪型2号(S2)弱毒活菌苗

2.4羊型5号(M5)弱毒活菌苗

2.5牛型45/20

2.6羊型53H38灭活佐剂苗

2.7粗糙型牛种51(Rough strainB.abortus，RB51)疫苗

2.8VTRM1和VTRS1突变株疫苗

2.9基因工程苗

2.10反向免疫学构建疫苗

参考文献

第二章 实验研究

实验一 同源重组载体pcds与pvds的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

实验二 羊种布鲁氏菌M5-90 OMP31,Virb2基因敲除

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

实验三 羊种布鲁氏菌M5-90 OMP31蛋白原核表达

1材料和方法

2结果

3讨论

总结与创新点:

参考文献

附录

致谢

作者简介