甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究

摘要

甜瓜细菌性斑点病的病原菌包括细菌性果腐病菌（Acidovorax avenae subsp.citrull）和细菌性角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.Lachrymans），该病已成为近年来影响新疆甜瓜生产的重要因素。因此，探索防治甜瓜细菌性斑点病的有效方法已成为重要课题。本实验室已从新疆甜瓜根际土壤中分离到一株甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13，琼脂扩散法生物活性研究表明，其发酵液对细菌性果腐病菌BFB、细菌性角斑病菌P4的抑菌圈直径分别为19 mm和17 mm以上。本文对其分类地位、摇瓶发酵条件和发酵液中抑菌物质的性质及其初步分离纯化进行研究。结果如下： 1.明确了甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13的属。根据形态特征、生理特性测定和16S rRNA序列的系统发育分析，初步鉴定菌株P-13为娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）。 2.明确了菌株P-13发酵液中抑菌物质的性质。甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13发酵液中抑菌物质主要为胞外代谢产物，不溶于石油醚、乙醚和乙酸乙酯等有机溶剂。进而对该物质稳定性进行研究，在100℃处理10 min、pH6处理6h或紫外线照射7h，该物质抑菌活性不变。纸层析结果表明，该物质主要为碱性水溶性物质。 3.探索了菌株P-13产生抑菌物质的培养基组成、培养基初始pH、摇瓶装液量、接种量、发酵温度和发酵时间等摇瓶发酵条件。采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验设计、旋转中心组合设计和响应面分析法优化培养基组成，最优培养基组成为葡萄糖15 g/L、可溶性淀粉5 g/L、蛋白胨3 g/L、（NH4）2SO43.206 g/L、CaCO36 g/L、K2HPO4·3H2O0.6 g/L、MgSO4·7H2O0.6 g/L、NaCl0.158 g/L、FeSO4·7H2O0.006 g/L和ZnSO4·7H2O0.002 g/L。单因素试验确定最佳摇瓶发酵条件为培养基初始pH7.0、摇瓶装液量60 mL/500 mL、接种量4％（V/V）、发酵温度28℃和发酵时间5.0d，发酵液抑菌圈直径为30.51 mm；比初始值21.17 mm提高了44.12％。通过试验设计对发酵培养基和摇瓶发酵条件的优化，抑菌活性显著提高。 4.离子交换法研究表明，采用弱酸性阳离子树脂D152，使抑菌物质得到了富集和浓缩。离子交换法操作条件如下：发酵液经过预处理后，以90 mL/h流速上装好的NH4+型树脂D152离子交换柱，上柱时发酵液与树脂的体积比为8：1；用蒸馏水以6倍树脂体积的蒸馏水流速为45 mL/h洗涤树脂柱；然后用9倍树脂体积的0.1 mol/L盐酸以流速为45 mL/h洗脱。 通过对发酵液中抑菌物质的性质及其初步分离纯化方法的研究，为抑菌物质的精制和结构鉴定提供依据，也为菌株P-13进一步的开发利用提供理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

引言

第一章文献综述

1.1生防放线菌的研究进展

1.2放线菌分类的研究进展

1.3微生物产品的分离纯化

1.4生物防治的发展趋势

1.5本论文的研究内容

1.6研究目的和意义

第二章甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13的鉴定

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4小结

第三章发酵液中抑菌物质的性质初步研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4小结

第四章甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13摇瓶发酵优化

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4小结

第五章抑菌物质的初步分离纯化

5.1前言

5.2材料与方法

5.3结果与分析

5.4小结

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

附录 PCR产物序列测定结果

致谢

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