小凹蛋白-1调节细胞外钙敏感受体介导NO生成的作用机制

摘要

目的：1探讨小凹蛋白-1(Cav-1)上调人脐静脉内皮细胞(HUVEC)钙敏感受体(CaR)介导一氧化氮(NO)生成的作用机制。
　　方法：(1)胰蛋白酶消化法原代培养HUVEC，倒置显微镜下进行细胞形态学观察及免疫细胞化学法测Ⅷ因子对其进行抗原鉴定。(2)取2～5代HUVEC随机分组：不同浓度filipin处理组(1.5mg/L,2mg/L,2.5mg/L)，采用Westernblotting技术提取细胞总蛋白检测Cav-1、eNOS和p-eNOS蛋白的表达。(3)取2～5代细胞随机分组：对照组(Ca2+-free/HBS)；CaR激动剂精胺(spermine,2mmol/L)+Ca2+组；Caveolae结构破坏剂(filipin,1.5mg/L)+spermine+Ca2+组；Cav-1ShRNA+spermine+Ca2+组；空质粒(Vehicle)+spermine+Ca2+组；Westernblotting技术检测Cav-1、eNOS、p-eNOS总蛋白和Cav-1、eNOS膜蛋白的表达；免疫荧光双标技术检测Cav-1和eNOS表达、共定位；免疫共沉淀(Co-IP)技术检测Cav-1和eNOS相互作用。(4)实验数据用均数±标准误表示，组间比较用单因素方差分析，均数间的比较采用t检验或卡方检验。所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：(1)细胞形态学与免疫细胞化学法测Ⅷ证实原代培养的细胞为HUVEC。(2)HUVEC经不同浓度filipin(1.5mg/L、2mg/L和2.5mg/L)处理后Cav-1、eNOS和p-eNOS蛋白表达结果显示：各加药组与Control组相比，均无统计学意义(P>0.05)。(3)总蛋白Westernblotting检测结果显示：与Control组相比，spermine+Ca2+组和Vehicle+spermine+Ca2+组中p-eNOS蛋白表达增加(P<0.05)；与Control组和spermine+Ca2+组相比，filipin或Cav-1干扰处理后，p-eNOS蛋白表达减少(P<0.05)，Cav-1ShRNA组Cav-1蛋白表达亦减少(P<0.05)；各组eNOS蛋白表达均无差异(P>0.05)。(4)小凹(Caveolae)提取结果显示：Cav-1和eNOS共定位于同一Caveolae区，filipin处理组Cav-1在Caveolae表达较对照组减少(P<0.05)。(5)膜蛋白提取结果如下：同Control组和spermine+Ca2+组比较，filipin或Cav-1干扰处理后，Cav-1和eNOS膜蛋白表达均减少(P<0.05)。(6)免疫细胞化学技术检测HUVEC中Cav-1与eNOS蛋白表达呈阳性，两者共定位于膜上，经filipin处理后Cav-1和eNOS膜上定位减少，与eNOS在核周边聚集明显增多，Cav-1干扰后，eNOS亦较多聚集在核周边。(7)Co-IP检测结果如下：与Control组和spermine+Ca2+组比较，Cav-1ShRNA处理组Cav-1和eNOS相互作用减弱(P<0.05)，其余各组CaR、Cav-1蛋白表达(正向和反向)均无统计学差异(p>0.05)。
　　结论：在HUVEC中，Cav-1和eNOS共定位于同一Caveolae区，并存在相互作用，两者相互作用在功能上表现为：Cav-1上调CaR介导eNOS激活作用，机制可能与Cav-1影响eNOS质膜定位及抑制eNOS向细胞器转位有关。

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中文摘要

英文摘要

中英文缩略词对照表

前 言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂及配制

3 主要仪器设备

4 实验方法

5 统计分析

结 果

1 HUVEC的形态与鉴定

2 Cav-1结构破坏对HUVEC中Cav-1、p-eNOS和eNOS表达的影响

3 Cav-1 RNAi转染效率观察及干扰效率的验证

4 不同处理因素刺激下HUVEC中Cav-1、eNOS和p-eNOS蛋白表达

5 脂筏提取、鉴定及同一含 Caveolae 的膜碎片中 Cav-1 和 eNOS的共定位研究

6 两种提取膜蛋白方法的比较

7不同处理因素刺激下HUVEC内eNOS膜蛋白表达

8 免疫细胞化学技术检测不同处理因素刺激下HUVEC中Cav-1和eNOS蛋白表达、共定位

9 免疫共沉淀检测HUVEC中eNOS和Cav-1的相互作用

讨 论

一、Cav-1在CaR介导NO生成中作用

二、Cav-1在CaR介导NO生成中作用的机制研究

结论

参考文献

综述

1 脂筏的生物学特性

2 脂筏介导的信号转导

3 脂筏与SOC(STIM1,Orai1,TRPC1)的关系

4 结语与展望

参考文献：

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文