原头蚴/囊液体外对小鼠脾细胞免疫逃避中的作用

摘要

目的：
　　本研究通过建立原头蚴/囊液和小鼠脾细胞的共培养体系,观察该体系中TGF-β分泌量、CD4+CD25+Foxp3+T(Treg细胞)比例、CD4+/CD8+T细胞比值、以及NK细胞活性受体NKG2D的表达水平和NK细胞杀伤活性等一系列变化情况;探讨原头蚴/囊液抗原是否通过促进脾细胞分泌抑制性分子TGF-β从而促进CD4+CD25+Foxp3+T细胞分化,从而进一步下调NK活性受体NKG2D表达水平,最终导致NK细胞对原头蚴的杀伤减弱,而形成对宿主的免疫逃避。
　　方法：
　　1.取BALB/c小鼠脾细胞,制备成细胞悬液,加入不同浓度囊液/原头蚴混合培养为实验组,加入PBS作为对照组;培养72小时后,用ELISA法检测共培养体系的上清液中TGF-β含量;同时收集共培养的细胞作为效应细胞,取Yac-1作为靶细胞(小鼠NK细胞的靶细胞,其细胞表面无MHC-I类分子表达),用LDH酶法检测共培养后NK细胞的免疫活性,同时用流式细胞仪检测NK细胞表面活性受体NKG2D的表达水平。
　　2.同法,取BALB/c小鼠脾细胞,制成悬液,加入不同浓度囊液/原头蚴为实验组,加入PBS作为对照组;共培养72小时后,离心收集细胞,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+细胞比值及CD4+CD25+T细胞的含量,RT-PCR法检测Foxp3mRNA基因的相对表达量;
　　3.相同浓度的原头蚴/囊液和BALB/c小鼠脾细胞悬液共培养,在0、12、24、36、48h收集细胞,检测T淋巴细胞亚群的变化情况。
　　结果：
　　1.与对照组相比,囊液组和原头蚴组的TGF-β分泌均有所增加,有统计学意义(p<0.01);囊液组随抗原的浓度增多而增加,其中在高浓度500ul时达到最大值;而原头蚴组则在浓度为1000个/ml时达到较大值,另外结果显示,囊液抗原的作用要强于原头蚴。囊液/原头蚴组都在干预24h后TGF-β分泌显著上调,与对照组相比有统计学意义(p<0.01)。
　　2.和对照组相比,囊液组中NK细胞的活性受体明显下调,在高浓度组的时候含量下降,有统计学意义(p<0.05),并且随着抗原的浓度增加或作用时间的增加,而NK细胞活性下降越明显,与对照组相比有统计学意义(p<0.05)。而原头蚴组对NKG2D的影响作用不大。
　　3.通过流式细胞检测囊液和原头蚴组的CD4+/CD8+细胞的比值越来越小,与对照组比较有差异(p<0.05)。
　　4.低浓度囊液(100ul、200ul)和原头蚴(500个/ml)的CD4+CD25+T细胞的含量比例较对照组有显著的差异(p﹤0.01),而且在随着抗原含量增加时CD4+CD25+T细胞的含量比例是逐渐下降;特异性蛋白Foxp3的表达量在囊液组(100ul、200ul)和原头蚴组(500个/ml、1000个/ml)时和对照组也有统计学差异(p﹤0.05)。
　　结论：
　　1.细粒棘球蚴囊液和原头蚴抗原在体外都能刺激小鼠脾细胞TGF-β分泌增加。提示包虫感染后可能通过上调该抑制性分子的表达水平而促进免疫逃逸。
　　2.细粒棘球蚴囊液和原头蚴抗原在体外都能降低NK细胞的杀伤活性,且囊液的作用要强于原头蚴;囊液能下调NK细胞活性受体NKG2D的表达,原头蚴对NKG2D的影响比较小。提示包虫早期感染中,可能通过降低宿主NK细胞杀伤活性而促进虫体免疫逃逸。
　　3.细粒棘球蚴囊液和原头蚴抗原都能促进CD4+T细胞的量下降,CD8+T细胞的比例上升,导致CD4+/CD8+T细胞比值降低;猜测包虫感染后可能通过促进形成CD8+T细胞的为主的免疫状态,有利于包虫逃避宿主的免疫杀伤。
　　4.细粒棘球蚴囊液和原头蚴都能上调CD4+CD25+T细胞的比例,及Treg特异性蛋白Foxp3的表达水平;推测T细胞在囊液和原头蚴抗原的刺激下向Treg细胞分化的趋势增加,CD4+CD25+T细胞通过分泌TGF-β调节和抑制宿主的免疫反应。

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前 言

第一部分：原头蚴/囊液对小鼠脾细胞TGF-β分泌及NK细胞活性的影响

1. 材 料

1.1主要仪器和试剂

1.2 主要病原体采集及小鼠来源

2.方 法

2.1 原头蚴制备

2.2 囊液制备

2.3小鼠脾细胞悬液制备

2.4 进行分组实验

2.5 用ELISA法检测上清液中TGF-β含量

2.6 原头蚴和脾细胞的分离实验

2.7用LDH酶法检测原头蚴/囊液对小鼠NK细胞的活性的影响

2.8 用流式细胞仪检测NK细胞表面受体NKG2D的变化

2.9.统计学分析：

3.结 果

3.1.原头蚴/囊液对体外培养小鼠脾细胞TGF-β表达影响

3.2 原头蚴/囊液对小鼠NK细胞活性及表面受体NKG2D的表达影响

4. 讨 论

第二部分：原头蚴/囊液体外对体外培养小鼠T细胞的影响

1.材料及试剂（同第一部分）

2.方 法

2.1 实验方法和实验分组同第一部分

2.2 用流式细胞仪检测混合培养后T细胞亚群及CD4+CD25+T的变化

2.3 RT-PCR检测脾细胞Foxp3 m RNA 的相对表达量

2.4 PCR反应

2.5.统计学分析：

3.结 果

3.1 囊液对体外培养小鼠脾细胞T淋巴细胞亚群变化的影响

3.2 原头蚴对体外培养小鼠脾细胞T淋巴细胞亚群变化的影响

3.3原头蚴/囊液对小鼠脾细胞CD4+CD25+T细胞的影响

4.讨 论

4.1原头蚴/囊液对体外培养小鼠脾细胞T淋巴细胞亚群的影响

4.2 原头蚴/囊液对小鼠脾细胞CD4+CD25+T细胞及Foxp3 mRNA基因的影响

结 论

参考文献

文献综述

4.2 消除免疫反应

参考文献

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文