PI3K/AKT和MEK/ERK通路调控H3K27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表达的研究

摘要

组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰,参与基因的表达调控。组蛋白H3K27me3是抑制基因转录的表观遗传修饰标记之一,可以抑制靶基因的转录。目前研究发现,组蛋白H3K27me3受组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的调控。其中,Zester同源增强子2是组蛋白H3K27甲基化转移酶,EZH1是它的同源物,它们都是Polycomb蛋白家族的成员。UTX和JMJD3是组蛋白H3K27me3去甲基化酶。PI3K/AKT信号通路对组蛋白甲基化酶EZH2基因表达已经有报道,但在成肌细胞分化过程中是否调控组蛋白H3K27甲基化酶和去甲基化酶的表达还不清楚,我们用小鼠成肌细胞C2C12为研究材料,采用免疫印迹、染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,CHIP)、定量PCR(Q-PCR)的方法研究PI3K/AKT信号通路在成肌细胞分化阶段对组蛋白H3K27甲基化酶EZH1/EZH2和去甲基化酶UTX/JMJD3的表达调控。此外,在多种肿瘤组织中检测到EZH2存在过表达的现象,UTX和JMJD3也被检测到发生突变或者表达下降。MEK/ERK信号通路是生物体内广泛存在的一条信号通路,参与调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡等生命过程。在某些癌症细胞中,MER/ERK信号通路参与调控EZH2基因的表达。为了进一步研究这条通路对组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的调控。我们以C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-61-6、RD五种细胞系为研究对象,用RT-PCR和Western-Bloting方法分析检测MER-ERK信号通路对组蛋白H3K27甲基化酶EZH2/EZH1基因和去甲基化酶UTX/JMJD3基因的表达。结果如下:
　　磷酸化的AKT在成肌细胞分化过程中逐渐升高,EZH1和JMJD3蛋白表达变化不明显,EZH2蛋白表达降低,到第6和第7d蛋白降到最低值,UTX蛋白表达升高。
　　成肌细胞分化过程中用PI3K/AkT信号通路激活剂处理24h后,Myogenin和MCK蛋白表达升高,H3K27me3在Myogenin基因启动子区和MCK基因启动子及增强子区的富集与对照组相比降低。UTX蛋白表达略微升高,JMJD3、EZH1和EZH2蛋白与对照相比变化不明显。用PI3K/AKT号通路抑制剂处理24h后,Myogenin和MCK蛋白表达降低,H3K27me3在Myogenin基因启动子区和MCK基因启动子及增强子区的富集与对照组相比升高,UTX和EZH2蛋白表达均降低,其中JMJD3和EZH1蛋白表达降低不明显。
　　不同浓度的MEK/ERK信号通路抑制剂U0126(0、10、20、40umol/L)处理24h后,在五种细胞磷酸化的ERK1/2表达水平随着浓度的升高逐渐降低;EZH1和EZH2基因mRNA表达水平与对照相比有不同程度的降低,EZH1基因mRNA表达变化没有达到显著水平,EZH2mRNA在NIH3T3、C2C12、RD、HEPA1-6四种细胞表达变化达到显著水平(P<0.05),EZH2蛋白表达在五种细胞系内都降低,其中C127细胞变化最不明显,HEPA1-6细胞变化最为显著。组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX基因在C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-6、RD五种细胞mRNA表达变化不明显,JMJD3基因mRNA表达变化达到显著水平(P<0.05),JMJD3蛋白表达普遍升高,但在RD细胞蛋白表达升高不明显。
　　对HEPA1-6细胞免疫荧光检测,EZH1和UTX蛋白在细胞质和细胞核内都有表达,EZH2蛋白在细胞核内表达比较强,JMJD3在细胞质内表达比较强。加入MEK/ERK信号通路抑制剂U0126处理细胞24h后,与对照相比,EZH2、EZH1、UTX、JMJD3变化不明显。
　　MEK/ERK信号通路抑制剂U0126处理HEPA1-6和RD两种细胞系24h后,在两种细胞的细胞核内EZH1表达变化不明显,EZH2蛋白表达显著降低。UTX和JMJD3蛋白在HEPA1-6细胞细胞核内表达升高,在RD细胞细胞核没有明显变化。
　　用MEK/ERK信号通路抑制剂U0126处理HEPA1-6细胞,不同的时间点检测蛋白表达的变化。U0126处理2hP-ERK1/2降低,随后表达水平逐渐升高,到24h升高到最大,但与对照相比仍然降低。EZH1没有明显变化。EZH2蛋白处理8h后蛋白表达减弱明显,24h蛋白表达降低到最低水平。JMJD3和UTX蛋白在处理4h后表达升高到最大值,随后表达逐渐减弱。
　　siRNA-ERK1、siRNA-ERK2、siRNA-ERK1/2干扰HEPA1-6细胞,EZH2和EZH1蛋白表达都有不同程度的降低,EZH1变化不明显,JMJD3蛋白表达明显升高,但UTX在siRNA-ERK1干扰后蛋白升高不明显,siRNA-ERK2和siRNA-ERK1/2干扰后蛋白表达升高明显。
　　结论:PI3K/AKT信号通路在成肌细胞分化过程中可能参与调控EZH2和UTX的表达,但可能有别的信号通路共同参与调控。MEK/ERK信号通路对EZH1没有明显的调控作用,可能参与调控EZH2、UTX和JMJD3基因的表达,但这种调控具有细胞特异性和时序性。

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缩略词表（Abbreviations）

第一章文献综述表观遗传学的研究进展

1.1表观遗传学

1.2PI3K/AKT信号通路的研究

1.3 MEK/ERK信号通路的研究

1.4研究的目的和意义

第二章成肌细胞分化过程EZH1/EZH2和UTX/JMJD3的表达前言

2.1材料与方法

2.2结果

2.3分析和讨论

第三章 成肌细胞分化过程中PI3K/AKT通路调控EZH1/EZH2和UTX/JMJD3的表达

前言

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 分析与讨论

第四章MER/ERK信号通路调控EZH1/EZH2和UTX/JMJD3基因的表达

前言

4.1 材料与方法

4.2结果

4.3 分析和讨论

第五章 MER/ERK信号通路在肿瘤细胞调控EZH1/EZH2和UTX/JMJD3的表达

前言

5.1 材料与方法

5.2结果

5.3 分析和讨论

第六章 结论

第七章 创新点

参考文献

致谢

导 师 简 介

个 人 简 介