新疆小拟南芥液泡膜质子焦磷酸酶(V-H+-PPase)基因的克隆、表达及功能分析

摘要

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-H+-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在多种非生物胁迫适应性中起着重要的作用。
　　目的:以新疆小拟南芥(Olimarabidopsispumila)为研究材料,克隆液泡膜质子转运无机焦磷酸酶基因,进行基因的组织表达和胁迫表达分析,并通过在模式植物中过量表达进行基因功能的初步分析。
　　方法:基因的克隆采用RT-PCR和RACE技术;基因的表达分析采用半定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)和实时荧光定量PCR(quantitativeReal-timeRT-PCR,qRT-PCR)技术;构建过表达载体p35S:OpVP,分别采用花滴法和叶盘法转化拟南芥和烟草,通过检测转基因植株和非转基因植株的相关生理指标的变化,从而分析OpVP基因的功能;通过激光共聚焦显微镜观察转p35S:OpVP-GFP拟南芥根尖细胞的GFP信号进行亚细胞定位分析。
　　结果:(1)从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了一个V-H+-PPase基因,命名为OpVP。OpVP基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6％,98.4%。系统进化分析表明OpVP基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP蛋白是由两个单体组成的二聚体蛋白。(2)OpVP基因在小拟南芥根、茎、叶、花和果荚等组织中都有表达,但在叶和花中的表达相对更高;500mmol/LNaCl,1μmol/LABA,20%PEG6000,1μmol/LIAA和2μmol/LGA3明显诱导OpVP基因的表达。(3)亚细胞定位初步确定OpVP定位在液泡膜上。(4)经过200mmol/LNaCl胁迫后,转p35S:OpVP烟草植株的叶绿素a、b含量显著高于非转基因烟草,而叶片丙二醛含量均低于转基因烟草植株。转基因烟草植株叶片中积累更高浓度的Na+。
　　结论:OpVP属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因,主要是一个液泡膜定位蛋白。OpVP基因在小拟南芥根、茎、叶、花、果荚等组织中均有表达,其表达明显受到NaCl,ABA,PEG6000,IAA和GA3的诱导。转p35S:OpVP烟草叶片中积累更多的Na+,其耐盐能力得到一定程度的提高。本研究表明过量表达OpVP基因,可以提高转基因植株的耐盐能力。

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主要缩略表

引言

第一章 文献综述

1.1 植物耐盐机制研究现状

1.2 液泡膜质子焦磷酸酶的研究现状

1.3 小拟南芥的研究现状

1.4 本课题研究的目的及意义

第二章 小拟南芥V-H+-PPase基因OpVP的克隆和生物信息学分析

2.1 材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 结论

第三章 液泡膜质子焦磷酸酶基因OpVP的表达分析

3.1 材料和试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 结论

第四章 转基因研究

4.1 材料与试剂

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 结论

第五章 结果与讨论

参考文献

致谢

作 者 简 介