棉花黄萎病菌黑色素合成途径相关基因的克隆及功能分析

摘要

大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)引起的棉花黄萎病是世界范围内分布最广、危害最重的病害之一。由于大丽轮枝菌实验室条件下培养生长周期长,功能基因组的复杂程度高,长期以来该病菌功能基因组的研究相对滞后,使得致病机理一直没有得到阐明。在病害循环过程中黑色素化的微菌核是该病害主要的初侵染来源,病原菌在生长过程中产生的黑色素在致病性方面起重要作用。通过分析已报道的黑色素合成途径中的相关基因序列设计兼并引物以新疆棉花黄萎菌强致病力菌株V592为材料,通过PCR、克隆和测序,获得真菌DHN黑色素合成途径中的一个关键酶—聚酮合成酶(PKS)基因的全序列,为6742bp(登录号:KC422576)。序列分析显示,该基因由4个外显子和3个内含子组成,其开放阅读框(ORF)编码2189个氨基酸;具有I型聚酮合成酶(PKSI)基因的结构特征:含有1个酮基合成酶(KS)结构域,2个酰基载体蛋白(ACP)结构域,1个酰基转移酶(AT)结构域,2个磷酸泛酰巯基乙胺结合位点(PP)结构域,1个硫酸酯酶(TE)结构域。以KS编码氨基酸序列构建系统关系树,结果表明产生相同多聚酮次生代谢物质的真菌具有相同的进化来源,V592与产生黑色素(melanin)的其他真菌处于相同的进化分支上,而产生其他次生代谢产物的真菌则分别形成不同的进化分支,因此推测棉花黄萎菌PKS基因与黑色素的产生相关。
　　同时通过ATMT的方法筛选1144个突变体得到了91个不产生黑色素的白化体,荧光检测结果显示阳性率为87.9％。选取其中20个白化体进行southernblot实验,单插入率为20%。同时选取10个白化体进行染色体步移实验得到了T-DNA插入破坏的部分基因,对注释基因的生物信息学分析表明这些基因均涉及细胞的周期调控等方面。基因组的功能验证主要通过基因敲除进行验证,本实验利用同源重组原理,构建了部分T-DNA插入破坏基因的敲除载体进行ATMT的转化实验,为进一步研究黑色素合成相关基因的基因功能奠定基础。

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第一章 文献综述

1.1棉花黄萎病概况

1.2黄萎病的致病机制

1.3微菌核的研究

1.4黑色素

1.5大丽轮枝菌的功能基因组研究现状

1.6研究方法

1.7研究目的和意义

第二章 棉花黄萎菌聚酮合成酶基因的克隆与序列分析

2.1 材料和方法

2.2 结果分析

2.3. 讨论与结论

第三章 棉花黄萎菌T-DNA插入黑色素形成突变体的筛选及T-DNA侧翼序列的克隆

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3结论与讨论

第四章 棉花黄萎病菌黑色素合成相关基因敲除载体的构建

4.1材料和方法

4.2结果与分析

4.3结论与讨论

参考文献

致谢

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