As2O3联合Canstatin基因治疗对人肝癌HepG2细胞血管生成拟态的影响及机制研究

摘要

目的：以As2O3、Canstatin及二者联合方案分别干预三维培养的肝癌HepG2细胞，观察各干预因素对血管生成拟态（VM）形成能力（VM数量、长度及面积）的影响，探讨其影响机制，为抗肝癌血管形成提供新策略和实验依据。
　　方法：⑴CCK-8法确定As2O3（1、5、10、15、20μmol/L）对HepG2细胞的最适作用剂量；⑵RT-PCR法鉴定重组腺病毒；⑶流式细胞术检测不同转染复数（MOI=10、20、40、60、80）的腺病毒转染HepG2细胞（24h、48h、72h）的转染率，western-blot检测转染细胞Canstatin和Caspase-3蛋白的表达；⑷体外基质胶三维培养HepG2细胞，PAS染色法鉴定VM；⑸不同干预因素对HepG2细胞形成VM的影响，实验分空白对照组、As2O3组(1/2IC50、IC50、2IC50)、Canstatin组、As2O3(1/2IC50、IC50)与Canstatin联合组，各因素干预体外培养细胞12h后种胶，分别于种胶0.5h、2h、12h、24h、48h、72h倒置显微镜观察下拍照，记录测量VM（环状结构）的数量、长度及面积。⑹RT-PCR实验鉴定细胞中VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表达；⑺Western-blot检测各因素干预体外培养细胞12h后VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表达变化。
　　结果：①经SPSS17.0软件计算得出As2O3作用HepG2细胞72h的半数抑制浓度IC50(10μmol/L)为后续实验最适用药剂量；②PCR产物测序序列识别为人Canstatin基因；③确定2次、48h，MOI=80为后续实验转染方式。Western-blot检测转染细胞中Canstatin的表达为强阳性，Caspase-3的表达与对照组没有差异；④三维培养发现细胞种胶2h后开始变形、延伸并相互连接，12h时相邻的细胞相互聚集成明显的条索样结构，72h时边缘逐渐光滑，细胞开始向上堆积生长，PAS染色后HepG2细胞形成的环状条索样结构被染成紫红色；⑤不同方案处理细胞三维培养72h后，倒置显微镜50倍视野下拍照，图片应用IPP软件计算VM的长度、数量和面积，统计分析。结果显示，VM的长度、数量和面积，在1/2IC50组分别为4.90±0.91，22.00±9.17，0.177±0.013，IC50组分别为2.70±1.04，2.00±1.41，0.079±0.006，与对照组8.34±0.91，48.67±8.08，0.309±0.017比较P<0.01，1/2IC50组与IC50组比较P<0.05；Canstatin与As2O3联合组能够抑制VM，与对照组比较P<0.05，但联合组与As2O3组比较P>0.05；Canstatin组与对照组比较P>0.05；⑥PCR产物测序结果显示，细胞中存在VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表达；⑦western-blot结果显示，1/2IC50组VE-cadherin相对表达量为1.79±0.13，IC50组为0.62±0.06，与对照组2.56±0.13比较差异有统计学意义P<0.05，1/2IC50组与IC50组MMP-2的相对表达量1.96±0.09、1.10±0.03与对照组2.79±0.13相比差异有统计学意义P<0.05，而凋亡相关蛋白Caspase-3和增殖相关蛋白PCNA的相对表达没有差异P>0.05，Canstatin组各蛋白的相对表达与对照组相比P>0.05，联合组能抑制VE-cadherin、MMP-2的表达，但与As2O3单药组比较P>0.05，对Caspase-3、PCNA的表达没有影响。
　　结论：⑴肝癌HepG2细胞在体外三维培养条件下具有形成血VM的能力；⑵As2O3组对VM有抑制作用，可能与As2O3抑制了VE-cadherin跟MMP-2的表达有关；⑶联合组对VM也有抑制作用，但与As2O3组比较没有明显差异；⑷Canstatin对HepG2细胞Caspase-3的表达及VM的形成没有影响。

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主要符号表及缩略词

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果(Result)

1 CCK-8法确定最适As2O3作用剂量

2 重组腺病毒Canstatin目的基因的鉴定

3 重组腺病毒转染复数的确定

4 肝癌Hep G 2细胞三维培养及VM鉴定

5 不同干预因素对肝癌HepG 2细胞VM形成能力的影响

6 RT-PCR实验鉴定VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表达结果

7 Western-blot法检测各组中VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA表达变化

讨论

结论

参考文献

文献综述

参考文献

致谢

作 者 简 介

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