羊种布鲁氏菌043强毒株BR0524、BRA0434基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价

摘要

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌属（Brucella）引起的一种在全世界范围内广泛流行、以侵害人类和动物生殖系统为主要特征的细菌性人畜共患传染病。近年来，布鲁氏菌相关毒力因子的研究已成为国内外研究的重点和热点，然而，关于布鲁氏菌具体的致病机制和毒力因子的具体数量与功能等方面仍不十分清楚，这严重制约了抗菌药物和疫苗的研发。前期，本研究室采用生物信息学和比较基因组学等方法将羊种布鲁氏菌043强毒株与猪种布鲁氏菌1330标准株、S2菌苗株的全基因组 DNA进行了全面的对比分析和研究，有趣的是，我们发现 BR0524和 BRA0434基因在 S2菌苗株的基因组 DNA上是不存在的，而在043强毒株与1330标准株的基因组 DNA上均有该两个基因的存在，而且，目前在国内外的研究中尚未发现有关该两个基因的功能的报道。为此，本文以此发现作为出发点，初步探讨 BR0524和 BRA0434基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响，这将为进一步研究该两个基因在布鲁氏菌中的功能提供理论支持与科学依据。现将本文所做的主要工作与成果汇总如下：
　　1.羊种布鲁氏菌043株 BR0524、BRA0434基因缺失突变株的构建及鉴定。以羊种布鲁氏菌043为模板分别高保真扩增 BR0524和 BRA0434基因的同源臂，以 pUC19K质粒为模板高保真扩增卡那霉素抗性基因；通过融合 PCR的方法将上述获得的片段融合到一起，以 pMD18-T Simple载体为骨架构建重组质粒，将其电转化至羊种布鲁氏菌043感受态细胞，并对抗性克隆进行筛选和鉴定。结果显示：经过对抗性克隆进行筛选和菌液 PCR鉴定之后，最终获得了羊种布鲁氏菌043ΔBR0524、ΔBRA0434缺失突变株，并且，该两株缺失突变株在15代内未发生回复性突变现象，遗传性稳定。
　　2.生长特性的检测。将ΔBR0524、ΔBRA0434与羊种布鲁氏菌043分别接种于布鲁氏菌液体培养基中，以每2h作为时间点，分别测定其 OD值的变化情况，直至细菌的生长速度进入平台期，并分别绘制ΔBR0524、ΔBRA0434与羊种布鲁氏菌043的生长曲线。结果显示：ΔBR0524、ΔBRA0434的生长曲线均与羊种布鲁氏菌043趋于一致，即差异不显著（P＜0.05）。
　　3.ΔBR0524毒力的初步评价。将ΔBR0524、羊种布鲁氏菌043和 M5与小鼠巨噬细胞为100:1的感染比例（即 MOI=100:1）侵染小鼠巨噬细胞（RAW264.7），并以106 CFU剂量腹腔接种小鼠，进行体内感染试验。结果显示：与羊种布鲁氏菌043相比，ΔBR0524的毒力几乎没有下降（P＜0.05），并且，对小鼠脾脏重量变化的影响也趋于一致（P＜0.05）。
　　4.ΔBRA0434毒力的初步评价。将ΔBRA0434、羊种布鲁氏菌043和 M5与小鼠巨噬细胞为100:1的感染比例（即 MOI=100:1）侵染小鼠巨噬细胞（RAW264.7），并以106 CFU剂量腹腔接种小鼠，进行体内感染试验。结果显示：与羊种布鲁氏菌043相比，ΔBRA0434的毒力有所下降，并且，对小鼠脾脏重量变化的影响也有一定程度的下降。本文的研究结果表明ΔBR0524和ΔBRA0434均具有良好的遗传稳定性；BR0524基因的缺失不会对对羊种布鲁氏菌043的生长状态和毒力功能的发挥产生显著的影响；BRA0434基因的缺失也不会对羊种布鲁氏菌043的生长状态产生显著的影响，但是会对羊种布鲁氏菌043毒力功能的发挥产生一定的影响。

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英文缩略词表

引言

第一章 文献综述 布鲁氏菌毒力因子的研究进展

1 布鲁氏菌的致病机理

2 布鲁氏菌的毒力因子

3 展望

第二章 实验部分

实验一 羊种布鲁氏菌 043 强毒株 BR0524、BRA0434 基因缺失突变株的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验二 羊种布鲁氏菌 043ΔBR0524 和 ΔBRA0434 缺失突变株初步的毒力评价

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

创新点

参考文献

致谢

作者简介

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