布鲁氏菌D5基因缺失菌株构建及其毒力、免疫效力的评价

摘要

为评估布鲁氏菌粗糙型疫苗使用的可行性,研发新型布鲁氏菌安全、具有诊断标记的粗糙型基因缺失疫苗,本文从羊种布鲁氏菌突变文库中筛选出粗糙型突变菌株,经反向PCR、测序与blast发现,该粗糙型突变株是由于LPS的OPS合成基因受到影响,从中选定D5基因缺失、评价;利用非标记的基因同源重组技术对羊布鲁氏菌D5基因删除,获得羊布鲁氏菌缺失菌株D5。通过吖啶黄凝集试验和结晶紫染色试验鉴定该基因缺失菌株D5为粗糙型菌株；进一步小鼠体内毒力试验显示D5脾脏载菌量远低于其母本菌株羊种布鲁氏菌(B.melitensis)16M,而与疫苗菌株M5相对,D5脾脏载菌量在4、6、8周较高,但第1周载菌量较低,并且第16周就先降低到检测限以下,证明该缺失菌株毒力明显下降；D5接种小鼠不同时间点血清样品虎红平板凝集试验检测结果显示,该缺失菌株不产生机体产生针对LPS的抗体,具有血消学诊断意义。而小鼠体内免疫保护试显示,以脾脏载菌量为标准,D5在第12周、16周和20周相较于PBS具有免疫保护力,但其效力明显低于M5。从本研究结果证明,成功缺失D5基因后得到具有粗糙型表型、毒力下降的羊布鲁氏菌缺失菌株D5,其在小鼠体内具有一定的免疫保护力,但相对疫苗菌株M5较弱,其作为疫苗候选菌株的可能性需要进一步通过本动物评价。