BSMV诱导小麦SBEIIa和SSIIa基因沉默及其对直链淀粉和抗性淀粉合成的影响

摘要

抗性淀粉是一类对人体健康有益的碳水化合物。目前关于抗性淀粉的研究主要集中于制备和测定方法的确立及生理功效等方面的研究，而对其形成机理及其酶学机制的研究报道较少。基于大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)的病毒诱导基因沉默技术（BSMV-VIGS）在小麦的基因功能研究方面得到了广泛的应用。本研究采用BSMV-VIGS技术，在小麦中研究淀粉合成关键酶SBEⅡa和SSⅡa基因与抗性淀粉之间的关系，期望能从分子水平上解释其形成机理。主要研究内容包括：
　　⑴VIGS重组载体的构建。采用同源克隆的方法分别构建VIGS重组载体。结果表明，成功构建了γ-PDS、γ-SBEIIa、γ-SSⅡa和γ-SBEⅡa-SSIIa四个VIGS重组载体。
　　⑵在小麦穗部和籽粒中建立 BSMV-VIGS系统。在小麦抽穗时，通过摩擦法在小麦穗部接种BSMV:PDS重组载体和空病毒（BSMV:00）。在接种BSMV:PDS后第5-6d的小麦穗部发生了光漂白，接种后第15-16d出现比较明显的光漂白，到接种后25-27d光漂白现象达到了最大程度。接种BSMV:PDS第25d穗子的籽粒也发生了光漂白。而接种BSMV:00小麦穗部和籽粒中均没有发生光漂白。实时荧光定量PCR结果表明，相对于接种BSMV:00的植株，接种BSMV:PDS后发生光漂白的穗子和籽粒的PDS基因的相对表达量表现出明显的下调。
　　⑶在小麦籽粒中单独诱导SBEⅡa和SSⅡa基因沉默及其对直链淀粉和抗性淀粉合成的影响。实时荧光定量PCR检测结果发现，相对于接种BSMV:00的植株，接种BSMV:SBEⅡa植株的SBEⅡa基因相对表达量出现显著下降。接种BSMV：SSⅡa植株的SSⅡa基因相对表达量也出现了明显的下调。检测接种BSMV:SBEIIa（BSMV:SSⅡa）后引起SBEIIa（SSⅡa）基因沉默植株的直链淀粉和抗性淀粉含量发现，相对于接种对照BSMV:00的植株，接种BSMV:SBEⅡa穗子的籽粒的直链淀粉含量增加了18.62％，抗性淀粉含量升高了11.61%，接种 BSMV:SSⅡa穗子的籽粒的直链淀粉含量增加了24.48%，抗性淀粉含量升高了16.67%。
　　⑷在小麦籽粒中同时诱导SBEⅡa和SSⅡa基因沉默及其对直链淀粉和抗性淀粉合成的影响。实时荧光定量PCR检测结果表明，相对于接种BSMV:00的植株，接种BSMV:SBEIIa-SSⅡa植株的SBEⅡa和SSⅡa基因的相对表达量均出现显著下降。检测直链淀粉和抗性淀粉含量发现，相对于接种对照BSMV:00的植株，接种BSMV:SBEⅡa-SSⅡa并发生SBEⅡa和SSⅡa基因同时沉默的穗子的籽粒的直链淀粉含量增加了32.02%，抗性淀粉含量升高了22.33%。
　　⑸采用BSMV-VIGS技术在小麦发育的籽粒中单独和同时诱导SBEⅡa和SSIIa基因沉默。SBEⅡa和SSⅡa基因单独和同时沉默都能引起直链淀粉和抗性淀粉含量的提高；SSⅡa基因比SBEIIa基因对直链淀粉和抗性淀粉合成的影响更大。SBEⅡa和 SSⅡa基因与直链淀粉和抗性淀粉的合成有正向协同作用。说明 SBEⅡa和SSⅡa基因与直链淀粉和抗性淀粉合成密切相关。

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缩略词表

引言

第一章 文献综述

1.1 植物基因功能研究策略

1.2 病毒诱导基因沉默技术及其在禾本科植物中的应用

1.3 小麦淀粉合成关键酶SBEIIa和SSIIa基因的研究进展

1.4 抗性淀粉的研究进展

1.5本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 试验材料、试剂及仪器

2.2 试验方法

2.3 数据统计分析

第三章 结果与分析

3.1 小麦籽粒总RNA的提取及cDNA第一链的合成

3.2 小麦各目的基因的克隆和测序

3.3 VIGS重组载体的构建

3.4 VIGS载体的线性化

3.5 体外转录

3.6 在小麦穗部和籽粒中诱导PDS基因沉默

3.7 VIGS技术分别诱导SBEⅡa和SSⅡa基因沉默对小麦籽粒淀粉含量的影响

3.8 VIGS技术同时诱导SBEⅡa和SSⅡa基因沉默对小麦籽粒淀粉含量的影响

第四章 讨论与结论

4.1 BSMV载体的开发应用

4.2 影响BSMV-VIGS技术应用的因素

4.3 BSMV-VIGS技术诱导SBEIIa和SSIIa基因沉默

4.4 BSMV-VIGS技术应用的展望

4.5 结论

参考文献

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致谢

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